Primär- und Sekundärfluoreszenz an pflanzlichen Präparaten

Als Fluoreszenz bezeichnet man die kurzzeitige und spontane Emission von Licht beim Übergang eines angeregten Systems in einen Zustand mit niedrigerem Energieniveau (in der Regel in den Grundzustand, also den energieärmsten Zustand dieses Systems). Dabei ist das emittierte Licht regulär energieärmer und somit langwelliger als das bei der Anregung absorbierte Licht.

Fluoreszenz kann an Atomen, Molekülen, Ionen und Nanopartikeln auftreten. Solche fluoreszierende Systeme nennt man auch Fluorophore. Fluoreszenz kann nicht nur durch Lichteinstrahlung (Photolumineszenz), sondern z.B. auch durch die Zufuhr von Wärmeenergie (Thermolumineszenz), eine chemische Reaktion (Chemolumineszenz), Ladungstransport in einer Gasentladung (Elektro- lumineszenz) oder Ultraschall (Sonolumineszenz) ausgelöst werden.

Bei der Anregung durch Licht absorbiert ein Elektron mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit ein Lichtquant des eingestrahlten Lichts und geht dabei in einen angeregten Zustand über, der um das Energieniveau des Lichtquants über seinem Grundzustand liegt. Nach einer kurzen Zeit (wenige Nanosekunden) fällt das Elektron unter Abgabe der zuvor aufgenommenen Energie wieder in seinen Grundzustand zurück. Ein Teil dieser Energie wird wieder als Licht abgestrahlt, ein weiterer geht als Schwingungsrelaxation verloren.
Aus dem Energieerhaltungssatz folgt somit zwingend, dass die Wellenlänge des emittierten Lichts nie kleiner (= energiereicher) als die Wellenlänge des Anregungslichts sein kann. Diese Gesetzmäßigkeit wird auch nach dem Entdecker der Fluoreszenz (Sir Georg Gabriel Stokes, 1852) als Stokes Shift oder Stokesverschiebung bezeichnet [1]. Im Falle gleicher Wellenlängen bei Anregung und Emission spricht man von der Resonanzfluoreszenz, der Anteil der über die Schwingungsrelaxation abgebauten Energie ist dabei gleich Null.

Auch im Gewebe der Pflanzen finden sich einige Fluorophore. Dazu gehört in erster Linie das Chlorophyll, der grüne Farbstoff, mit dessen Hilfe die Pflanze Lichtenergie in chemische Energie umwandelt (Photosynthese). Aber auch andere Bestandteile der Pflanzenzellen zeigen Primärfluoreszenz bei entsprechender Anregung. Dies gilt z.B. für Baustoffe sklerifizierter Zellwände und verschiedene sekundäre Pflanzenstoffe, wie das Berberin, die durch die typische Fluoreszenz identifiziert werden können.

Wie in allen physikalischen Systemen treten auch bei der Photosynthese Verlustleistungen auf. Es wird also nicht die gesamte vom Chlorophyll absorbierte Energie der Lichtquanten über die Elektronentransportkette zur Synthese von Kohlehydraten aus Wasser und Kohlendioxid eingesetzt. Ein Teil geht als Wärmestrahlung oder eben Lichtemission (Fluoreszenz) verloren.

Die beobachtete Chlorophyllfluoreszenz ist also ein Teil der Verlustleistung des Photosynthesesystems. Die Zeit bis zum optimalen Ablaufen der Photosynthese (also bis zum Erreichen einer stabil niedrigen Intensität der Chlo- rophyllfluoreszenz) kann als Maß für die Vitalität einer Pflanze angesehen werden. Darauf beruhen verschiedene Messmethoden im Bereich des Umweltschutzes, über die der Schädigungsgrad von Pflanzengemeinschaften z.B. durch Umweltbelastungen dargestellt werden kann.

Zunächst wird eine alkoholische Chlorophyllösung aus den Blättern der zu untersuchenden Pflanze erstellt. Diese werden dazu im Mörser mit 96% Ethanol zerrieben und anschließend filtriert. Natürlich gehen dabei auch andere Fluorophore aus den Blättern in Lösung, die ihren Niederschlag in den Messdiagrammen finden, aber für eine grobe Übersicht reicht dieses einfache Verfahren aus.
Die Lösung kommt nun in einer Messküvette in den Strahlengang des Fluoreszenzspektrometers und wird mit einer zunächst beliebig gewählten Anregungswellenlänge (hier 470 nm im sichtbaren blauen Bereich) bestrahlt. Dabei wird die Intensitätsverteilung des emittierten Lichts im Bereich von 500 bis 850 nm gemessen. Das relevante Maximum der Emissionskurve liegt bei 658 nm im roten sichtbaren Bereich.

Nun wird umgekehrt gemessen, um fest zu stellen, bei welcher Anregungswellenlänge die Intensitätsausbeute bei der Emissionswellenlänge der eben gemessenen 658 nm am höchsten ist. Der Messbereich liegt dabei zwischen 250 und 500 nm und die beste Ausbeute wird bei einer Wellenlänge von 434 nm erreicht. Der Peak bei 280 nm im Anregungs-Diagramm beruht auf einer Verunreinigung und ist mikroskopisch auch nicht nutzbar, da er sehr weit im UV-Bereich liegt und für die Fluoreszenzmikroskopie weder Lichtquellen noch Filtersätze für Wellenlängen unter 365 nm erhältlich sind.

Auf die gleiche Weise wurde für das Berberin bei einer Anregung von 365 nm ein Maximum bei etwa 520 nm sowie eine Bande des mitextrahierten Chlorophylls bei 670 nm ermittelt.

In den Diagrammen ist jeweils die relative Intensität gegen die Emissions- oder Anregungswellenlänge in nm aufgetragen. Die Intensität beschreibt hier die Anzahl von Lichtquanten einer vorgegebenen Wellenlänge. Eine Änderung der Intensität bedeutet also keine Änderung der Energie der einzelnen Quanten, die ausschließlich durch die Wellenlänge bestimmt sind.

Die Spektren sind für die jeweiligen Stoffe (Fluorophore) charakteristisch und erlauben bei entsprechend sauberem Arbeiten mit dem Fluoreszenz- spektrometer die Quantifizierung von Stoffen selbst bei Konzentrationen bis hinunter zu 5 ng/l.

Die hier gezeigten Schnitte stammen vom Kriechenden Hahnenfuß (Ranunculus repens), dem scharfen Hahnenfuß (Ranunculus acris) und der Blutberberitze (Berberis thunbergii 'Atropurpurea'). Mikroskopiert wurde mit einem Zeiss Axioskop mit LED Auflichtfluoreszenzeinrichtung, die Aufnahmen wurden mit der Zeiss Axiocam mit Chipkühlung gemacht.

Für die Primärfluoreszenz wurde Frischmaterial der genannten Pflanzen mit dem Zylindermikrotom oder dem Rasierklingenmikrotom geschnitten. Da der Einsatz von Ethanol zu viele der relevanten Pflanzenstoffe auslösen würde, wurde mit Wasser gearbeitet. Um eine ausreichende Benetzung zu erreichen und damit die Bildung von Luftblasen im Schnitt zu vermeiden, wurde dessen Ober- flächenspannung durch Zugabe von Ochsengalle herabgesetzt. Ochsengalle (Fel tauri) ist ein Netzmittel, das aus Rindergalle gewonnen wird und als gelbes Pulver oder wässrige Lösung dieser Farbe in den Handel kommt.
Die Präparation der Spross- und Blattquerschnitte erfolgte durch Rolf-Dieter Müller, die Aufnahmen sind von Horst Wörmann. Die Erläuterungen zu den einzelnen Aufnahmen finden sich in den Bildunterschriften.

Für die Sekundärfluoreszenz wurden die Schnitte mit AFE fixiert und nach Müller W3ASim II gefärbt (der Arbeitsplan für die W3ASim Färbungen kann hier heruntergeladen werden). Die Acridinfarbstoffe Acridinrot und Acriflavin der W3ASim Färbung sind Fluorophore und erlaubt somit die Hervorhebung hauptsächlich der lignifizierten Zellwände.

Die Präparation der Spross- und Blattquerschnitte erfolgte durch Rolf-Dieter Müller, die Aufnahmen sind von Horst Wörmann. Die Erläuterungen zu den einzelnen Aufnahmen finden sich in den Bildunterschriften.