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Kontrastverfahren: Phasenkontrast, DIC und Jamin-Lebedeff Interferenzkontrast

Prof. Holger Adelmann, vom 14.05.2011

Unser Auge ist ein empfindlicher Detektor für Licht im Wellenlängenbereich von Violett bis Rot. Das Auge nimmt dabei Helligkeitsänderungen wahr als Folge unterschiedlicher Lichtabsorption oder Lichtreflektion durch den zu betrachtenden Gegenstand. Farbe entsteht dabei einfach durch selektive Absorption oder Reflektion von bestimmten Wellenlängen aus einem weißen, somit gemischten Beleuchtungslicht durch ein so genanntes Amplitudenobjekt. Das Auge ist also ein Detektor für Helligkeits-(Licht)-Amplituden.
Unterschiedliche Laufzeiten (somit Phasenunterschiede) des Lichtes, die durch ein 'Phasenobjekt' erzeugt werden, kann unser Auge hingegen nicht erkennen. Hierzu muss der Mensch Hilfsmittel einsetzen, welche die unserem Auge unsichtbaren Phasenunterschiede wiederum in Helligkeits- also Amplituden- unterschiede umsetzen und damit für uns wahrnehmbar machen.
Die gängigsten Verfahren zur Sichtbarmachung von Phasenunterschieden in der Mikroskopie sind die eng miteinander verwandten Methoden des Phasen- kontrastes und des Interferenzkontrastes.
Beide verwenden dabei das Phänomen der Lichtinterferenz, auch wenn das im Phasenkonstrast vom Namen her nicht sofort klar wird.
Die Erklärung der mikroskopischen Abbildung durch Beugung des beleuchtenden Lichtes am Objekt und die anschließende Interferenz von beleuchtendem und abgebeugtem Licht zur Erzeugung der mikroskopischen Abbildung ist im Prinzip ähnlich, egal ob es sich um 'normale' Amplitudenobjekte oder um Phasenobjekte handelt. Das Phasenobjekt erzeugt dabei ein Phaseninterferenzbild welches, genauso wie das Phasenobjekt selbst, für das Auge unsichtbar ist.
Allerdings unterscheiden sich die Phasen der Beugungswellen von Amplitudenobjekt und Phasenobjekt in Relation zur der Phase der Beleuchtungswelle: Diese Phasendifferenz beträgt in der Objektebene (und auch der Bildebene) bei einem Amplitudenobjekt lambda/2, bei einem Phasenobjekt allerdings nur lambda/4. Wenn man also nun die Phasendifferenz zwischen Beugungswellen und Beleuchtungswelle im Falle des Phasenobjektes von lambda/4 auf lambda/2 verändern würde, wäre die Verhältnisse wie beim Amplitudenobjekt, und die Interferenz der beiden Wellen müsste dann ein helligkeitsmoduliertes Interferenzbild geben, welches das Auge wahrnehmen kann.
Phasenkontrastmikroskopie
Phasenkontrast-Einrichtungen, Leitz Druckschrift 513-5c, IV/70 [1]. Mit freundlicher Genehmigung von Leica Microsystems (© Leica Microsystems, www.leica-microsystems.com)
Diese theoretischen Überlegungen hat der holländische Physiker Frits Zernike umgesetzt:
Er schlug vor, die Phase des beleuchtenden Lichtes durch einen Phasenring (zunächst war es ein streifenförmiges Phasenplättchen) in der hinteren Objektivbrennebene um lamda/4 zu beschleunigen (positiver Phasenkontrast) oder zu verlangsamen (negativer Phasenkontrast). Dadurch haben Beleuchtungswelle und Beu- gungswellen nun wieder eine Phasendifferenz von lambda/2 zueinander und können wie beim Amplitudenobjekt zu einem helligkeitsmodulierten Bild interferieren.
Zweckmäßigerweise schwächt man die Amplitude der Beleuchtungswelle um ca. 75% ab, um ein kontrastreiches Bild zu erhalten. Damit die Beleuchtungswelle unabhängig von der Beugungswelle beeinflusst
werden kann, kommt die Beleuchtungswelle als ringförmige Apertur, welche auf die Dimensionen des Phasenringes abgestimmt ist. Die Beugungswellen sind praktisch über die gesamte hintere Brennebene des Objektes verteilt, sie werden vom Phasenring nur gering beeinflusst, allerdings leider doch insofern, dass Objektbereiche mit großen Phasenunterschieden von einem Halo umgeben sind, welches die Grössenbestimmung sowie die qualitative Betrachtung oftmals stört. Bedingt durch die Lage und Dimension des Phasenplättchens ist die maximale ringförmige Beleuchtungsapertur im Phasenkontrast nicht ganz so groß zu realisieren wie in einem vergleichbaren Hellfeldfall.
Interferenzmikroskopie
Die Interferenzmikroskopie im Durchlicht beruht im Prinzip auf der Zweistrahlinterferenz:
Das vom Polarisator kommende linear polarisierte Licht wird durch einen geeigneten Strahlenteiler in zwei von der Polarisationsebene senkrecht zueinander stehenden und auch lateral versetzten Teilstrahlen aufgespalten. Diese durchsetzen das Objekt gemäß ihres lateralen Versatzes an verschiedenen Stellen und werden danach von einem dem Strahlenteiler analogen Strahlenvereiniger wieder räumlich kombiniert, schwingen allerdings noch in den verschiedenen Ebenen. Der nachfolgende Analysator erzwingt die Einnahme einer einzigen Schwingungsebene, dabei werden die jeweiligen in der Durchlassrichtung des Analysators schwingenden Vektoranteile der Wellen kombiniert und können zum Amplitudenbild interferieren. Man unterscheidet bei der Zweistrahlinterferenz zwei Fälle, welche sich durch die Größe der lateralen Strahlaufspaltung in der Objektebene unterscheiden:
  • die differentielle Bildaufspaltung, wobei die räumliche Strahlaufspaltung unterhalb des Auflösungsvermögens des Objektives liegt (differentieller Interferenzkontast 'DIC')
  • die totale Bildaufspaltung, wobei die die räumliche Strahlaufspaltung deutlich oberhalb des lateralen Auflösungsvermögens des Objektives liegt (z.B. Mach-Zehnder Prinzip und Polarisations-Interferenzverfahren nach Jamin-Lebedeff)
Differentieller Interferenzkontast 'DIC'
Differentieller Interferenzkontrast, prinzipielle Darstellung anhand der  Interferenzkontrast-Einrichtung T (für Durchlicht), Leitz Druckschrift 550-39a, IV/73 [2]. Mit freundlicher Genehmigung von Leica Microsystems (© Leica Microsystems, www.leica-microsystems.com)
Die Bildaufspaltung und -wiedervereinigung wird durch zwei Wollaston Prismen vorgenommen, z.B. in der von Smith vorgeschlagenen Anordnung: ein Prisma in der vorderen Brennebene des Kondensors, das andere in der hinteren Brennebene des Objektives. Insbesonders die Anordnung des objektivseitigen Primas in der hinteren Brennebene des Objektives ist konstruktiv aufwendig. Daher hat Nomarski modifizierte Wollaston-Prismen vorgeschlagen, die die Interferenzebene aus dem Prisma heraus verlagern, womit die Anordnung der Prismen technisch einfacher möglich ist. Von der Bildqualität her sind beide Techniken jedoch gleichwertig.
Es findet eine differenzielle Bildaufspaltung statt, d.h. die laterale Bildaufspaltung liegt unterhalb des lateralen Auflösungsvermögens des jeweiligen Objektives. Dabei erhält man eine pseudo- plastische Abbildung, in der die Stärke des Reliefs nicht nur durch die tatsächlichen Dicken- verhältnisse der Strukturen gegeben ist, sondern durch die Kombination von Dicke und Brechungsindex der Strukturen bestimmt wird. Daher ist eine vorsichtige Interpretation des erzielten Bildes unabdingbar.
Polarisations-Interferenzverfahren nach Jamin-Lebedeff
Interferenzkontrast nach Jamin-Lebedeff,  prinzipielle Darstellung anhand der Durchlicht-Interferenzeinrichtungen, Leitz Druckschrift 521-23a, XII/69 [3]. Mit freundlicher Genehmigung von Leica Microsystems (© Leica Microsystems, www.leica-microsystems.com)
Bei diesem Verfahren wird (im Gegensatz zum klassischen Mach-Zehnder Prinzip und Geräten wie z.B. dem großen Leitz-Interferenz Mikroskop nach Horn) Zweistrahl-Interferenz durch polarisationsoptische Mittel erzeugt.
Die Bildaufspaltung sowie -zusammenführung erfolgt direkt unterhalb und oberhalb des Objektes. Hierzu ist dem Kondensorkopf ein kippbares Strahlenteilerplättchen aufgelagert und der Objektivfrontlinse ist ein ebensolches Strahlenvereinigerplättchen vorgeschaltet. Diese Technik bringt allerdings eine gewisse Ein- schränkungen der maximal möglichen Apertur mit sich.
Die erzeugte Bildaufspaltung ist größer als das laterale Auflösungsvermögen des jeweiligen Objektives (ca 0,1 mm beim 40er, ca. 0,04 mm beim 100er Objektiv). Zur Kompensierung der optischen Weglängen der beiden Teilstrahlen nach der Aufteilung wird beim Jamin-Lebedeff Verfahren eine lambda/2 Platte verwendet. Da diese streng genommen nur auf eine bestimmte Wellenlänge abstimmbar ist, entsteht hier bei nicht streng monochromatischem Licht (der übliche Anwendungsfall) eine eliptisch polarisierte Komponente, welche dann ein lichtschwaches und verwaschenes Nebenbild hervorruft. Dieses ist lateral und axial zum Hauptbild versetzt. Aus letztgenanntem Grund eignet sich das Jamin-Lebedeff Verfahren nicht zur Beobachtung großflächiger Strukturen, da sich dann Haupt- und Nebenbilder überlagern.
Das Jamin-Lebedeff Interferenzmikroskop erzeugt Bilder, bei denen Unterschiede in Dicke und Brechungsindex nicht wie beim Phasenkontrast in einen Schwarz-Weiss Kontrast, sondern in einen Farbkontrast umgesetzt werden. Dies macht die Interpretation des Gesehenen noch diffiziler, als dies beim DIC-Verfahren der Fall ist.
Allerdings erlaubt das Jamin-Lebedeff Verfahren eine quantitative Mikroskopie, z.B. die sehr genaue Messung von optischen Weglängendfifferenzen, Brechungsindizes oder der Trockenmassen von Zellen.
Vergleichsbilder der drei Kontrastmethoden anhand einer Diatomee
Die Diatomee Eunotia pectinalis aufgenommen mit den drei beschriebenen Kontrastverfahren.  Von Links nach Rechts: Phasenkontrast, DIC und Jamin-Lebedeff. Die ersten beiden Bilder sind von der gleichen Alge gemacht, das dritte ist von einem anderen Individuum der gleichen Art. Die Diatomee Eunotia pectinalis aufgenommen mit den drei beschriebenen Kontrastverfahren. Von Links nach Rechts: Phasenkontrast, DIC und Jamin-Lebedeff. Die ersten beiden Bilder sind von der gleichen Alge gemacht, das dritte ist von einem anderen Individuum der gleichen Art.
Die Phasenkontrast-Aufnahme (links) hat das klassische Halo, dieses fehlt bei den beiden anderen Verfahren. Sie lässt sehr schön die feinen, vom Kern ausgehenden Plasmaausläufer erkennen, diese sind auch im Interferenzkontrast nach Jamin-Lebedeff (rechts) sehr kontrastreich, im DIC-Bild (mitte) aber nur schwach zu sehen.
Die DIC-Aufnahme (Mitte) hat eine wesentlich geringere Schärfentiefe als die Aufnahmen im Phasenkontrast oder Jamin-Lebedeff, was man im vorliegenden Bild noch erkennen kann, auch wenn sich die Alge bei der DIC Aufnahme leider etwas aus der Ebene gedreht hat. Dabei ist das DIC-Bild ist am farbtreuesten (und scheint auch die feinste Auflösung zu haben), das Phasenkontrast-Bild kommt mit Abstand dahinter (der Zellinhalt bei dieser Alge ist im Hellfeld gelbbräunlich, nicht grün!).
Die Aufnahme im Interferenzkontrast nach Jamin-Lebedeff (rechts) erhebt systembedingt keinerlei Anspruch auf Farbtreue. Hier kann man Details gut sichtbar machen indem man den Farbkontrast so einstellt, dass benachbarte Strukturen mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Gangunterschied und Strukturdicke sich farblich separieren.
Weitere Bilder
  • Diatomeen im Phasenkontrast
  • Eine Micrasterias thomasiana in ihrer ganzen Pracht. Gefunden im Hochmoor mit dem Gagelstrauch-Bestand. DIC.
  • Eine Larve oder Puppe? Noch ist das Tierchen unbestimmt. DIC.
  • Diatomeen im  Interferenzkontrast nach Jamin-Lebedeff.
  • Bruchstück eines Moosblattes aus einer Wasserprobe im Interferenzkontrast nach Jamin-Lebedeff.
Literatur
[1] Phasenkontrast-Einrichtungen
     Leitz Druckschrift 513-5c, IV/70

[2] Interferenzkontrast-Einrichtung T (für Durchlicht)
     Leitz Druckschrift 550-39a, IV/73

[3] Durchlicht-Interferenzeinrichtungen
     Leitz Druckschrift 521-23a, XII/69
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Diatomee im Interferenz-Phasenkontrast. Präparation und Aufnahme von Frank Fox.
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Rezente Diatomee Bacteriastrum furcatum Shadbolt aus dem Golf von Thailand. Aufnahme von Päule Heck.
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Mai 2012
Tracheen im Xylem des Korallenbaums, Spross, Färbung W3Asim II, Vergrößerung 200x. Aufnahme von Jörg Weiß.
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April 2012
Porträt einer zwei Tage alten Fliegen. Aufnahme von Horst-Dieter Döricht.
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März 2012
Aus der Schmelze kristallisiertes Methylsulfonal im polarisierten Licht. Aufnahme von Frank Fox
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Februar 2012
Die Kieselalge Achnantes longipes. Aufnahme von Frank Fox
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Januar 2012
Primäres Xylem und Markparenchym aus dem Spross der Gewöhnlichen Jungfernrebe. Ungefärbtes Präparat, Aufnahme von Jörg Weiß.
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Dezember 2011
Flügelschuppen eines Großen Fuchses (Nymphalis polychloros) im Auflicht. Aufnahme Frank Fox.
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November 2011
'Dazu muss ich sagen, dass es mir nicht um irgendeine Form wissenschaftlicher Fotografie ging. Ich habe wilde Gemische hergestellt und dann nachgesehen, wie das Produkt aus sah. ... Genieß' das Spiel der Farben und Formen.' Aufnahme von Herne.
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Oktober 2011
Glockentierchen (Vorticellidae) im differenziellen Interferenzkontrast. Aufnahme von Frank Fox.
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September 2011
Die Radiolarie Hexacontium papillosum aus einem Präparat von Albert Elger. Aufnahme von Päule Heck.
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August 2011
Querschnitt durch den Spross des Gartenbambus (Fargesia murieliae). Vergrößerung 100x, Färbung W3Asim II. Aufnahme Jörg Weiß mit Leica C-Plan 10x an Leica DME. Kamera Canon PS A520.
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Juli 2011
Micrasterias rotata aus einer Wasserprobe von der Wuppertalsperre. Aufnahme Holger Adelmann mit der Moticam 2300 am Leitz Orthoplan mit 40er Plan Fluotar und DIC.
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Juni 2011
Bild 1
Angeschliffene Foraminifere aus einem Hydrobienkalk des Untermiozän. Fundort Dexheim bei Mainz. Präparation Fa. Krantz, Aufnahme Prof. Holger Adelmann.
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Juni 2011
Bild 2
Kopf mit Mundwerkzeugen und vorderes Körperdrittel einer nicht näher bestimmten Zuckmückenlarve (Chironomus sp.). Präparation und Aufnahme von Frank Fox.
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Mai 2011
Querschnitt vom Rollblatt des Strandhafers (Ammophila arenaria), Schnittdicke ca. 50 µm, Färbung Wacker W3A. Stitch aus 240 Einzelaufnahmen mit Zeiss Standard WL, Plan Apo 25x/0.65, Kamera Canon EOS 5D MK II mit Vollformat-Chip. Stitching mit Canon Photostitch.
Präparat von Jörg Weiß, Aufnahme von Joachim Schwanbeck.
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April 2011
Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Abdruck von der Blattunterseite, erstellt mit UHU Hart. Hellfeld.
Vergrößerung 200x, Länge des Bildausschnitts im Objekt ca. 0,5 mm. Aufnahme und Präparation von Jörg Weiß.
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März 2011
Auskristallisierte Mineralstoffe aus flüssigem Kunstdünger. Zeiss Jenamed mit Planapochromat 12,4x CF250, polarisiert mit Lambda-Platte, Einzelaufnahme mit Vollformat-Kamera Canon 5D Mark II.  Aufnahme und Präparation von Frank Fox.
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Februar 2011
Nadelquerschnitt der Schlangenhaut-Kiefer (Pinus heldreichii). Aufnahme und Präparation von Rolf-Dieter Müller, Stitch aus ca. 70 Einzelbilder. Schnittdicke 25 µm, Färbung Wacker W3A (Acridinrot, Acriflavin, Astrablau).
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Januar 2011
Achtung, großes Bild!
Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Leitbündel. Aufnahme von Prof. Holger Adelmann, Präparat von Jörg Weiß.
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Dezember 2010
Metapelit, Dicke ca. 25 µm, Präparation durch Willi Tschudin, Aufnahme von Dr. Horst Wörmann.
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November 2010
Simocephalus vetulus (Anomopoda), der Plattkopf- Wasserfloh. Aufnahme von Päule Heck.
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