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Rund um das Hamburger Grün

Bild 1.0: Efeu Blattstiel Färbestufen Bild 1.0: Efeu Blattstiel Färbestufen
Jörg Weiß, vom 25.03.2023

Wie den meisten Freunden botanischer Färbungen bekannt, "funktioniert" das Rezept zum Alciangrün mit den derzeit erhältlichen Chargen des Farbstoffes Alciangelb nicht mehr. In seinem Thread Ersatz für Alciangelb hat Dr. Sven Kötter von der Mikrogruppe Hamburg einige Farbstoffe ausprobiert, um den Eindruck des Alciangrüns wieder zu erreichen und ist bei Titangelb (Thiazolgelb, CI 19540) hängen geblieben. Die so gefundene Färbung hat er als Hamburger Grün beschrieben. Hier das Originalrezept zum Hamburger Grün wie von Sven entwickelt:
 1007-information Original-Rezept Hamburger Grün nach Dr. Sven Kötter
  • Ausgangspunkt: AFE fixierte Schnitte in Ethanol 70%
  • oder: entparaffinierte Schnitte
  • Stufenweises Überführen der Schnitte in Aqua dest.
  • Neufuchsin-Chrysoidin-Farblösung 5-8 min. gelegentlich schwenken
  • kurz abspülen in Aqua dest.
  • in zwei Portionen Ethanol 30%ig abspülen (je 30 s)
  • in Ethanol 70%ig differenzieren (ca. 30-120 s)
  • in zwei Portionen Ethanol 30%ig abspülen (je 30 s)
  • Alcianblau-Färbelösung 2min mit einmaligem Erwärmen auf ca. 60°C
  • gut abspülen in Aqua dest.
  • Titangelb-Färbelösung 2min
  • gut abspülen in Aqua dest.
  • Entwässern in 3-4 Portionen abs. Isopropanol (je 1 min)
  • je nach Einschlussmittel über Xylol oder gleich in Euparal einschließen
Dazu werden die folgenden Farblösungen benötigt (ebenfalls nach Dr. Sven Kötter):

  • Neufuchsin-Chrysoidin-Farblösung: 10 mg Neufuchsin und 20 mg Chrysoidin werden in 98 ml dest. Wasser und 2 ml Eisessig gelöst und filtriert, dann mit einigen Kristallen Thymol versetzt. Der Ansatz ist 0.01%ig bezogen auf Neufuchsin und 0.02% bezogen auf Chrysoidin
  • Alcianblau-Farblösung: 0.2%ige Lösung von Alcianblau in sterilem Wasser incl. 2% Eisessig filtrieren, Zugabe von wenigen Kristallen Thymol
  • Titangelb-Farblösung: 0.5%ige Lösung von Titangelb in sterilem Wasser 2-3 h bei ca. 45°C rühren, über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen und filtrieren (dauert). Anschließend zu 10% mit sterilem Wasser verdünnen (beugt Ausfällungen infolge Temperaturerniedrigungen vor), Zugabe von wenigen Kristallen Thymol. Ansatz ohne Eisessig!

Update vom 30.04.2023: Hamburger Grün nach Original-Rezept

Zwischenzeitlich habe ich die von Sven verwendete Neufuchsin-Farblösung erhalten und konnte somit auch das Original-Rezept nachvollziehen. Ich stelle die entsprechenden Ergebnisse hier vor meine eigenen Experimente.

Zu den Ergebnissen nach der Originalrezeptur
Zu meinen eigenen Experimenten

Hamburger Grün nach Dr. Sven Kötter mit unterschiedlichen Differenzierungszeiten

Hier nun also das Hamburger Grün am Beispiel des Gemeinen Efeus (Hedera Helix).
Einige kleine Abweichungen gab es dann aber doch: ich habe mit ca. 50 mm dicken Schnitten vom Zylindermikrotom gearbeitet, die sicherlich dicker sind, als Svens Paraffinschnitte und ich habe Neufuchsin und Chrysoidin nicht als Gemisch sondern separat gefärbt und nach der Chrysoidinstufe ebenfalls bis kurz vor den Siedepunkt erhitzt. Eingedeckt habe ich in Euparal, was zu folgendem Ablauf führt:
 1007-information Hamburger Grün wie von mir durchgeführt

Fixierte und gründlich mit Aqua dest. gespülte Schnitte des Blattstiels von Hedera helix

  • Neufuchsin Lösung 0,1% 5 - 8 Minuten, gelegentlich schwenken
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Chrysoidin Lösung 1% 2 Minuten mit einmaligem leichen Erwärmen bis vor den Siedepunkt
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht

  • Differenzierung

  (1) ohne jegliche Differenzierung

  (2) Differenzierung gemäß Original-Anleitung
      2 * Spülen mit Ethanol 30%
      Differenzieren mit Ethanol 70% für ca. 60 Sekunden
      2 * Spülen mit Ethanol 30 %
      2 * Spülen mit Aqua dest.

  (3) Differenzierung gemäß Original-Anleitung
      2 * Spülen mit Ethanol 30%
      Differenzieren mit Ethanol 70% für ca. 120 Sekunden
      2 * Spülen mit Ethanol 30 %
      2 * Spülen mit Aqua dest.

  • Alcianblau Lösung 0,2% 2 Minuten, mit einmaligem leichtem Erwärmen bis vor den Siedepunkt: verdrängt das Chrysoidin aus den Parenchymen
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Titangelb Lösung 0,5% 3 Minuten
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht

  • Entwässern mit Isopropanol 99,9 % (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
  • Eindecken in Euparal
Die vewendeten Farblösungen sind:

  • Neufuchsin 0,1% in Aqua dest. angesäuert mit 2% Eisessig von Sven
  • Chrysoidin 1,0% in Aqua dest. mit einigen Kristallen Thymol auf 100 ml zur Stabilisierung
  • Alcianblau 0,2% in Aqua dest. mit einigen Kristallen Thymol auf 100 ml zur Stabilisierung
  • Titangelb 0,5% in Aqua dest. mit einigen Kristallen Thymol auf 100 ml zur Stabilisierung von Sven
Und hier nun die Ergebnisse der drei Färbegänge, jeweils mit:
  • einem Eindruck von den einzelnen Färbe- und Differenzierungsschritten als Einzelaufnahmen der freischwimmenden Schnitte in Aqua dest. (5x NPlan)
  • Einem aus mehreren Aufnahmen gestapelten Bild des frisch eingedeckten Schnittes mit allen relevanten Geweben (20x PlanApo)
  • Jeweils 4 Bilder zur Darstellung der Färbung im Detail nach 5 Tagen auf der Wärmeplatte: Übersicht (5x NPlan), Leitbündel (20x PlanApo), Detail Leitbündel und Randgewebe mit Cuticula (je 40x PlanApo)

(1) Ohne jegliche Differenzierung
(2) Differenzierung für 60 Sekunden
(3) Differenzierung für 120 Sekunden
(1) Ohne jegliche Differenzierung
Zunächst die Entwicklung der Färbung:
Bilder 1.1 - 1.4: Farbentwicklung ohne Differenzierung
  • Bild 1.1: Färbung mit Neufuchsin
  • Bild 1.2: Färbung mit Neufuchsin und Chrysoidin
  • Bild 1.3: Färbung mit Neufuchsin, Chrysoidin und Alcianblau
  • Bild 1.4: Färbung mit Neufuchsin, Chrysoidin, Alcianblau und Titangelb
Frisch eingedeckt sieht das Ganze dann so aus:
Bild 1.5: Frisch eingedeckter Schnitt ohne Differenzierung
Bild 1.5: Frisch eingedeckter Schnitt ohne Differenzierung
Und hier die vier Vergleichsbilder nach 5 Tagen auf der Wärmeplatte:
Bilder 1.6 - 1.9: Vergleichsbilder zur Färbung ohne Differenzierung
  • Bild 1.6: Übersicht
  • Bild 1.7: Leitgewebe
  • Bild 1.8: Leitgewebe Detail
  • Bild 1.9: Abschlussgewebe
(2) Mit 60 Sekunden Differenzierung nach dem Färben mit Chrysoidin
Zunächst die Entwicklung der Färbung:
Bilder 2.1 - 2.5: Farbentwicklung mit Differenzierung für 60 Sekunden
  • 2.1: Färbnung mit Neufuchsin
  • 2.2: Färbung mit Neufuchsin und Chrysoidin
  • 2.3: Färbung mit Neufuchsin und Chrysoidin nach Differenzierung für 60 Sekunden
  • 2.4: Färbung mit Alcianblau nach Differenzierung
  • 2.5: Färbung mit Alcianblau und Titangelb nach Differenzierung
Frisch eingedeckt sieht das Ganze dann so aus:
Bild 2.6: Frisch eingedeckter Schnitt nach Differenzierung für 60 Sekunden
Bild 2.6: Frisch eingedeckter Schnitt nach Differenzierung für 60 Sekunden
Und hier die vier Vergleichsbilder nach 5 Tagen auf der Wärmeplatte:
Bilder 2.7 - 2.10: Vergleichsbilder zur Färbung mit Differenzierung für 60 Sekunden
  • Bild 2.7: Übersicht
  • Bild 2.8: Leitgewebe
  • Bild 2.9: Leitgewebe Detail
  • Bild 2.10: Abschlussgewebe
(3) Mit 120 Sekunden Differenzierung nach dem Färben mit Chrysoidin
Zunächst die Entwicklung der Färbung:
Bilder 3.1 - 3.5: Farbentwicklung mit Differenzierung für 120 Sekunden
  • 3.1: Färbnung mit Neufuchsin
  • 3.2: Färbung mit Neufuchsin und Chrysoidin
  • Bild 3.3: Färbung mit Neufuchsin und Chrysoidin nach Differenzierung für 120 Sekunden
  • 3.4: Färbung mit Alcianblau nach Differenzierung
  • 3.5: Färbung mit Alcianblau und Titangelb nach Differenzierung
Frisch eingedeckt sieht das Ganze dann so aus:
Bild 3.6: Frisch eingedeckter Schnitt nach Differenzierung für 120 Sekunden
Bild 3.6: Frisch eingedeckter Schnitt nach Differenzierung für 120 Sekunden
Und hier die vier Vergleichsbilder nach 5 Tagen auf der Wärmeplatte:
Bilder 3.7 - 3.10: Vergleichsbilder zur Färbung mit Differenzierung für 120 Sekunden
  • Bild 3.7: Übersicht
  • Bild 3.8: Leitgewebe
  • Bild 3.9: Leitgewebe Detail
  • Bild 3.10: Abschlussgewebe
Fazit zur Originalfärbung
Zunächst zeigt sich, dass die von Sven vorgeschlagene Differenzierung nach der Färbung mit Neufuchsin und Chrysoidin absolut Sinn macht. Die Bilder 1.3, 1.4 und 1.5 zeigen eine "schmutzige" Färbung, bei der die Parenchyme noch fleckige Reste des Neufuchsins / Chrysoidins enthalten. Das schaut mit einer 60sekündigen Differenzierung schon besser aus (2.3 - 2.5 und 2.6) und führt mit 120 Sekunden Differenzierung zu einem richtigen Wow-Effekt in Bild 3.6. Neben den Lilatönen bei dem Kollenchym zeigt sich auch dissfunktionales Phloem in Lila und die Brillanz des Neufuchsins fällt sofort ins Auge.
Allerdings setzt sich die Differenzierung im eingedeckten Präparat fort und führt dazu, dass die Präparate ohne bzw. mit kürzerer Differenzierung nach den ersten beiden Färbestufen aufholen könen (Lilafärbung der Zellschichten unter der Epidermis und - nicht ganz so ausgeprägt des dissfunktionelan Phloems). Im für 120 Sekunden differenzierten Präparat sind die Lilatöne nun komplett verschwunden. Dabei ist leider auch die Brillanz des Neufuchsins aus Bild 3.6 etwas verloren gegangen.
Was bedeutet das nun für die Darstellung der anatomischen Details mit der neuen Färbung? Schauen wir einmal von innen nach aussen auf die jeweiligen Zelltypen:
  • Die Cuticula kommt dank der Färbung mit Chrysoidin und dem zugehörigen Erwärmen sehr gut zur Geltung. Das kräftige Orange verblasst jedoch erfahrungsgemäß mit der Zeit (gilt auch für die FCA Färbungen und Müller SAC)
  • Die Zellen der Epidermis erscheinen jeweils in Lila oder Grün
  • Die darunter liegenden Zellen mit etwas verdicketen Zellwänden ebenfalls - abhändig von der Differenzierung. Hier handelt es sich um ein Kollenchym, das auch im ungefärbten Schnitt gut zu erkennen ist. Über diese Zellen erfolgt u.A. die Krümmung des Blattstiels zur Ausrichtung der Blattspreite. Richtig differenziert kenne ich bis auf W3Asim I (blau - grün) keine andere Färbung, mit der diese Zellen andersfarbig hervorgehoben werden.
  • Die Parenchyme erhalten durch die Überfärbung mit Titangelb den gewünschten Grünton
  • Die Zellen der Sklerenchymkappen über den Leitbündeln zeigen sich nur im Präparat ohne Differenzierung im kräftigen Rot des Neufuchsins, bei den differenzierten Präparaten bleibt das Rot nur bei den Mittellamellen erhalten, die so aber sehr schön hervortreten. Dies ist auch bei vielen anderen Färbungen der Fall. Besonders gut schneiden hier die Färbungen der W3Asim - Familie mit roten Mittellamellen und verschiedenen Orangetönen der Zellwände der Sklerenchymzellen ab. Hintergrund ist, dass die Zellen der Sklerenchymkappen beim Blattstiel des Efeus nicht oder nur sehr schwach lignifiziert sind.
  • Das Phloem ist wie erwartet grün gefärbt, dissfunktionales Phloem erscheint lila oder ebenfalls grün (in der Variante mit 120 Sekunden Differenzierungszeit). Im Vergleich kenne ich keine Färbung, die diese abgestorbenen Zellen andersfarbig hervorhebt. Sie erscheinen aufgrund der Kompression in der Regel einfach nur dunkler als das umgebende Gewebe. Diese Kompression ist wohl auch der Grund dafür, dass sich das Neufuchsin hier länger halten kann und so zum lilanen Farbeindruck führt. Eine spezifische Farbbindung aufgrund des Zellwandaufbaus sehe ich nicht. Es hängt also vom Geschick bzw. dem Glück des Präparators ab, diesen Effekt zu erzielen, der sicher auch beim Kollenchym eine Rolle spielt. Dabei ist ebenfalls zu beachten, dass das Vorhandensein der hier angesprochenen abgestorbenen Phloemzellen sehr von der Probe, also der jeweiligen Wachstumssituation der Probepflanze und demn Alter des Blattstiels abhängt.
  • Die verholzten Zellen des Xylems (insbesondere die Tracheen und Tracheiden) können das Neufuchsin sehr gut halten, parenchymatische Zellwände z.B. der Markstrahlen erscheinen zuverlässig in Grün. Hier kommt der schöne, kräftige Farbton des Neufuchsins am besten zur Geltung, ob sich die Brillanz der Farbe im frisch eingedeckten Schnitt erhalten lässt, müssen weitere Experimente zeigen. Vielleicht hilft hier ein längeres Entwässern im Isopropanol vielleicht über 24 Stunden mit mehrfachen Wechsel (Achtung: Staub und Verdunstung :) ). Wichtig ist aber, am Anfang den Wassergehalt schnellstmöglich nach unten zu bekommen, was durch das Spülen im schnellen Wechsel passiert.
  • Das Markparenchym erscheint wieder im gewünschten Grün.
Alle hier geschilderten Eindrücke wurden zunächst nur anhand eines Blattstiels eines einzelnen alten Efeublattes gewonnen. Um die tatsächliche Leistungsfähigkeit der Färbung und auch ihre Grenzen zu erkunden, ist ein breiter Einsatz bei unterschiedlichsten Probepflanzen und auch bei dünneren Schnitten wünschenswert. Daher hoffe ich, dass Jens' neues Hamburger Grün eine breite Anwendung findet. Vielleicht vergleicht der eine oder andere Schnippler ja auch einmal mit seiner Lieblingsfärbung.
Weiterhin ist dem Hamburger Grün eine Verbreitung auch im Rahmen der kommenden Mikroskopiker-Treffen oder bei den Themenabenden der Mikroskopischen Gesellschaften zu wünschen. Das MKB wird dazu im Sommer auf jeden Fall eine Veranstaltung anbieten.
Zu guter Letzt noch einmal vielen Dank an Sven für seine Arbeit und die Offenlegung des Rezeptes des Hamburger Grüns!

Eigene Experimente

Mit Svens Rezept war es recht einfach, die Färbung nachzuvollziehen und ich habe einige weitere Kombinationen probiert. Zum Original fehlt mir jedoch die Neufuchsin-Chrysoidin-Lösung. Meine eigenen Versuche habe ich anhand von Querschnitten vom Blattstiel des Efeus gemacht, um vergleichbare Ergebnisse zum großen Färbungs-Vergleich auf der Webseite des MKB zu bekommen. Die Probe wurde frisch geschnitten und anschließend für 2 Stunden in AFE fixiert.

Die verwendeten Lösungen:
  • Acridinrot Färbelösung: 1% in Ethanol 50% , stabilisiert mit einigen Kristallen Thymol
  • Acriflavin Färbelösung: 1% in Aqua dest., stabilisiert mit einigen Kristallen Thymol
  • Alcianblau Färbelösung: 0,2% in Aqua dest., stabilisiert mit einigen Kristallen Thymol
  • Chrysoidin Färbelösung: 1% Chrysoidin in Aqua dest., stabilisiert mit etwas Thymol
  • Rhodamin B Färbelösung: 1% in Ethanol 50%, stabilisiert mit einigen Kristallen Thymol
  • Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin-Farblösung siehe RDM 5 auf unserer Webseite
  • Titangelb Färbelösung: Gemäß des Rezepts von Dr. Sven Kötter

Hier nun die Ergebnisse:

1. Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb

Das oben genannte Dreifachgemisch aus meinem Farbstoffregal kommt der Original-Färbung von Sven am nächsten. Die vorhandene Lösung noch aus dem Bestand des leider verstorbenen Rolf-Dieter Müller ist jedoch von geringer Konzentration und als Langzeitfärbung ausgelegt. Nach einem ersten Fehlversuch habe ich nach folgendem Rezept gefärbt:
 1007-information Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb
  • Ausgangspunkt: AFE fixierte Schnitte in Ethanol 70%
  • Stufenweises Überführen der Schnitte in Aqua dest.
  • Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin-Farblösung ca. 20 Stunden mit einmaligem Erwärmen bis kurz vor den Siedepunkt
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Alcianblau-Färbelösung 3 min
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Titangelb-Färbelösung 2min
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Kein weiteres Differenzieren notwendig
  • Entwässern mit Isopropanol 99,9 % (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
  • Eindecken in Euparal
Das Erwärmen dient dazu, dass das Chrysoidin (oder Acriflavin bei den Wacker-Färbungen) besser auf wachsartige Strukturen wie die Cuticula aufzieht. Sven hat im Original eine Erwärmung der Alcianblaulösung vorgeschrieben, um Farbmolekülcluster zu trennen und so ein besseres Aufziehen des Blautons zu ermöglichen, das werde ich in meinen nächsten Reihen auch einmal probieren. Hier habe ich aus Gewohnheit eine Minute länger gefärbt.

Zunächst die Entwicklung der Färbung nach den einzelnen Arbeitsschritten (freischwimmende Schnitte nach der letzten Spülung mit Aqua dest.):
Bilder 1.1 - 1.3: Färbestufen Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb
  • Nach Färbung mit Safranin-Diamantfuchsin-Chryxsoidin
  • Num mit Alcianblau im zweiten Gang
  • Und schließlich die komplette Färbung mit Titangelb
Da insbesondere die Färbung der Cuticula schnell verblassen kann, hier eine Aufnahme eines frisch eingedeckten Schnittes.
Bild 1.4: Farbwirkung direkt nach dem Eindecken
Bild 1.4: Farbwirkung direkt nach dem Eindecken: Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb
Nach 7 Tagen auf der Wärmebank (50 Grad) dann die folgenden Aufnahmen vom fertigen Präparat:
Bilder 1.5 - 1.8: Vergleichsbilder von den fertigen Präparaten (Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb)
  • Bild 1.5: Übersicht
  • Bild 1.6: Leitbündel
  • Bild 1.7: Detail
  • Bild 1.8: Cuticula
Wie man sieht, ist die Farbwirkung des Safranin-Diamantfuchsin-Chrysoidin Komplexes ziemlich verblasst aber auch die schwierige Cuticula ist noch etwas angefärbt.

2. Acridinrot und Acriflavin mit Alcianblau & Titangelb

Ein Ansatz nach Art einer Wackerfärbung darf natürlich auch nicht fehlen. Obwohl die Bestände des Acridinrots auch langsam zur Neige gehen. Seitdem der Farbstoff in der Textilindustrie nicht mehr verwendet wird, ist er auch nur noch zu hohen Preisen zu bekommen. Hier das zugehörige Rezept:
 1007-information Acridinrot und Acriflavin mit Alcianblau & Titangelb
  • Ausgangspunkt: AFE fixierte Schnitte in Ethanol 70%
  • Stufenweises Überführen der Schnitte in Aqua dest.
  • Acridinrot Lösung 1% 5 - 8 Minuten, gelegentlich schwenken
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Acriflavin Lösung 1% 2 Minuten mit einmaligem leichten Erwärmen bis vor den Siedepunkt
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Aclianblau Lösung 0,2% 2 Minuten
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Titangelb Lösung 0,5% 3 Minuten, verdrängt das Chrysoidin aus den Parenchymen
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Kein weiteres Differenzieren notwendig
  • Entwässern mit Isopropanol 99,9 % (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
  • Eindecken in Euparal
Zunächst wieder die Entwicklung der Färbung Schritt für Schritt, hier also vier Bilder, da ich Acridinrot und Acriflavin separat gefärbt habe.
Bilder 2.1 - 2.4: Färbestufen Acridinrot und Acriflavin mit Alcianblau & Titangelb
  • Acridinrot färbt zunächst unspezifisch den gesamten Schnitt
  • Acrflavin verdrängt das Acridinrot aus den Parenchymzellen
  • Alcianblau legt sich über die Gelbfärbung der Parenchyme, es entsteht der typisch grünblaue Farbeindruck der W3Asim II Färbung
  • Mit Titangelb verstärkt sich das Grün
Und nun wieder frisch eingedeckt in aller Pracht:
Bild 2.5: Farbwirkung direkt nach dem Eindecken
Bild 2.5: Farbwirkung direkt nach dem Eindecken: Acridinrot und Acriflavin mit Alcianblau & Titangelb
Hier wieder die Bilder vom fertigen Präparat:
Bilder 2.6 - 2.9: Vergleichsbilder von den fertigen Präparaten (Acridinrot und Acriflavin mit Alcianblau & Titangelb)
  • Bild 2.6: Übersicht
  • Bild 2.7: Leitbündel
  • Bild 2.8: Detail
  • Bild 2.9: Cuticula
Auch hier fällt auf, dass die schon schwächer angefärbte Cuticula noch weiter verblasst (vielleicht ist mein Isopropanol zu alt?). Die Färbung der sklerifizierten Zellen erfolgt - typisch für Acridinrot und Acriflavin in im Vergleich differenzierteren Rottönen.

3. Rhodamin B und Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb

Mit dem Einsatz von Rhodamin B hat schon Robin Wacker gepröbelt, sich wegen der besseren Eigenschaften in der Fluoreszenz aber für Acridinrot entschieden. Rolf-Dieter Müller hat das Rhodamin als Ersatz für das nur noch schwer erhältliche Acridinrot in die Nachfolgegeneration der Wackerfärbungen eingeführt. Hier nun in Kombination mit dem Titangelb:
 1007-information Rhodamin B und Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb
  • Ausgangspunkt: AFE fixierte Schnitte in Ethanol 70%
  • Stufenweises Überführen der Schnitte in Aqua dest.
  • Rhodamin B Lösung 1% 5 - 8 Minuten, gelegentlich schwenken
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Chrysoidin Lösung 1% 2 Minuten mit einmaligem leichen Erwärmen bis vor den Siedepunkt
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Aclianblau Lösung 0,2% 2 Minuten
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Titangelb Lösung 0,5% 3 Minuten, verdrängt das Chrysoidin aus den Parenchymen
  • Spülen mit Aqua dest. bis keine Farbe mehr abgeht
  • Kein weiteres Differenzieren notwendig
  • Entwässern mit Isopropanol 99,9 % (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
  • Eindecken in Euparal
Wie sicherlich schon erwartet die Entwicklung der Färbung:
Bilder 3.1 - 3.4: Färbestufen Rhodamin B und Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb
  • Auch Rhodamin B färbt zunächst wenig differenziert alle Gewebe an
  • Das Chrysoidin legt sich großzügig darüber ...
  • Erst das Alcianblau führt zu einer gewebegerechten Differenzierung
  • Und das Titangelb verstärkt wieder den Grünton bei den Parenchymen
Und frisch eingedeckt sieht das ganze dann so aus:
Bild 3.5: Farbwirkung direkt nach dem Eindecken
Bild 3.5: Farbwirkung direkt nach dem Eindecken: Rhodamin B und Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb
Zum Vergleich die Bilder vom fertigen Präparat:
Bilder 3.6 - 3.9: Vergleichsbilder von den fertigen Präparaten (Rhodamin B und Chrysoidin mit Alcianblau & Titangelb)
  • Bild 3.6: Übersicht
  • Bild 3.7: Leitbündel
  • Bild 3.8: Detail
  • Bild 3.9: Cuticula
Wir finden eine deutlich angefäbte Cuticula und schön differenzierte Gewebe in lebhaften Rot- und Grüntönen.

Fazit zu meinen eigenen Experimenten

Letztendlich gefällt mir die Färbung mit Rhodamin B und Chrysoidin im Ergebnis bisher am besten: eine schön angefärbte Cuticula und eine gute Differenzierung der Rottöne der sklerifizierten Zellen eingebettet in einen angenehmen Grünton. Passt!
Es bleibt jedoch abzuwarten, wie das Originalrezept von Sven sich am Blattstiel des Efeus zeigt. Sobald ich das Neufuchsin hier habe, lege ich entsprechend nach.
Literatur
[1]  Eine neue und einfache Methode zur polychromatischen
       Anfärbung von Paraffinschnitten pflanzlicher Gewebe für
       Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie

       Robin Wacker
       Mikrokosmos, Heft 4, 95. Jahrgang, S. 210 ff.
       Juli 2006
       PDF bei zobodat.at

[2]  Simultanfärbung von Pflanzenschnitten mit Fuchsin, Chrysoidin
        und Astrablau
       Dr. Helmut Etzold, Erlangen
       Mikrokosmos, Heft 5, 91. Jahrgang, S. 316 ff.
       September 2002
       PDF bei zobodat.at

[3]  Ersatz für Alciangrün
       Thread zum Hamburger Grün von Dr. Sven Kötter im Mikroforum,
       vom 17.02.2023

[4]  PDF zum Hamburger Grün
      Dr. Sven Kötter, Datei auf der Webseite der Mikrogruppe Hamburg,
      aufgerufen am 25.03.2023

[5]  Armin Aisner: Mikroskopische Färbemethoden - Etzold FCA
       Webseite von Armin Eisner, aufgerufen am 25.03.2023

[6]  Botanischer Färbungen im Vergleich
      Jörg Weiß, Webseite des MKB,
      vom 14.11.2029
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März 2021
Paramecium caudatum mit angefärbten Hefezellen in den Nahrungsvakuolen, Aufnahme von Frank Fox
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Februar 2021
Teilweise zersetzte Au-Te-Phase mit Goldabscheidung aus der Grube Glava von Dr. Holger Adelmann
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Januar 2021
Die Diatomee Navicula sparsipunctata aus der Fundstätte Omaru aufgenommen von Päule Heck
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Dezember 2020
Autofluoreszenz bei der Gewöhnlichen Esche (Fraxinus excelsior) von Rolf-Dieter Müller
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November 2020
Übergang zwischen Blattstielbase und Spross bei der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum) von Dr. Michael Miedaner
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Oktober 2020
Sporangien des Echten Wurmfarns (Dryopteris filix-mas) im Fluoreszenzkontrast von Frank Fox
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September 2020
Sprossquerschnitt von der Gewöhnlichen Robinie (Robinia pseudoacacia), Autofluoreszenz mit Violettanregung, von Rolf-Dieter Müller
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August 2020
Leitbündel im Spross der Exchten Kamille (Matricaria chamomilla L.) von Jörg Weiß
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Juli 2020
Rhizom von Ingwer (Zingiber officinale) mit Leitbündeln und Amyloplasten von Maria Beier
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Juni 2020
Zwei Widerstände auf einem älteren Chip (NPX 161) von Dr. Horst Wörmann
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Mai 2020
Eine Schalenamöbe Thecamoeben (Thecamoebida) im Interferenzkontrast von Frank Fox
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April 2020
Auflicht Makro von der Bereiften Hundsflechte (Peltigera rufescens), Aufnahme von Frau Dr. Andrea Berger
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März 2020
Querschnitt durch eine 3 Monate alte, trockene Probe vom Blattstiel des Purpur-Sonnenhuts (Echniacea purpurea) von Jörg Weiß
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Februar 2020
Querschnitt durch das Rhyzom des Süßholzes (Glycyrrhiza glabra) gefärbt mit W-Asim III nach Rolf-Dieter Müller. Aufnahme von Jörg Weiß
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Januar 2020
Micro- und Macronuclei von Gastrostyla mystacea in der Fluoreszenz. Aufnahme von Thilo Bauer
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Dezember 2019
Primärfluoreszenz einer quer geschnittenen Schwarzkiefernnadel von Rolf-Dieter Müller
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November 2019
Hibiskuspollen im UV Licht, Aufnahme von Frank Fox
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Oktober 2019
Leitbündel im Blatt von Ceratozamia robusta (Polarisationskontrast), Aufnahme von Jörg Weiß
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September 2019
Staubblatt mit Pollen einer gelben Hibiskusblüte von Horst-Dieter Döricht
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August 2019
Hinterleib einer Büschelmückenlarve (Chaoborus sp.) von Frank Fox
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Juli 2019
Die Diatomee Diploneis notabilis von Päule Heck
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Juni 2019
Die Zieralge Micrasterias denticulata von Jörg Weiß
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Mai 2019
Die Grünalge Scenedesmus quadricauda von Frank Fox
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April 2019
Blütenstand einer Schneeheide (Erica carnea) im Detail von Horst-Dieter Döricht
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März 2019
Sprossquerschnitt vom Beifußblättrigen Traubenkraut (Ambrosia artemisiifolia) in Kernschwarz/Solidgrün-Färbung von Rolf-Dieter Müller
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Februar 2019
Sandkörner und Schwammnadeln aus einem Elefantenohrschwamm im polarisierten Licht von Jörg Weiß
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Januar 2019
Blattstiel des Roten Eukalyptus (Eucalyptus camaldulensis) von Jörg Weiß
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Dezember 2018
Ein blaues Trompetentierchen (Stentor coeruleus) von Frank Fox
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November 2018
Leere Anthere des Beifußblättrige Traubenkrauts (Ambrosia artemisiifolia) von Maria Beier
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Oktober 2018
Ein Katzenfloh (Ctenocephalides felis) im Fluoreszenzkontrast von Frank Fox
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September 2018
Sternhaare auf der Blattunterseite einer Deutzie (Deutzia spec.) im Durchlicht von Dr. Horst Wörmann
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August 2018
Die Europäische Schwarze Witwe (Latrodectus tredecimguttatus). Von Horst Dieter Döricht.
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Juni 2018
Hypocotyl der Welwitschie (Wewitschia mirabilis, Jungpflanze). Von Jörg Weiß.
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Mai 2018
Autofluoreszenz beim Spross der Stechpalme (Ilex aquifolium).Von Rolf-Dieter Müller.
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April 2018
Eine Gruppe Glockentierchen der Art Carchesium polypinum mit Fluoreszenzbeleuchtung, Fokus auf das Zellinnere. Von Thilo Bauer.
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März 2018
Radiolarie in Rheinbergbeleuchtung von Frank Fox
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Februar 2018
Querschnitt durch den Spross des Roten Hartriegels (Cornus sanguinea) in W3Asim II Färbung von Jörg Weiß
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Januar 2018
Schuppenhaar der Silber-Ölweide (Elaeagnus commutata) im Hellfeld von Jörg Weiß
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Dezember 2017
Stempel, Narbe und Staubblätter des Hibiskus im UV-Licht. Aufnahme von Frank Fox
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November 2017
Eine Diatomee im Interphaco aus einem Präparat von Anne Gleich. Aufnahme von Frank Fox.
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Oktober 2017
Cilien auf der Oberfläche des Wimberntiers Spirostomum ambiguum im Fluoreszenzkontrast von Thilo Bauer.
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September 2017
Deckel der Sporenkapsel des Drehmooses (Funaria hygrometrica) im Auflicht von Horst-Dieter Döricht
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August 2017
Sporangien des Wurmfarns (Dryopteris spec.) in der Fluoreszenz von Frank Fox
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Juli 2017
Die Diatomee Aulacodiscus decorans (Schmidt) von Päule Heck
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Juni 2017
Mikroskopische Krokoitstufe von Horst-Dieter Döricht
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Mai 2017
Silikonschaum im Auflicht von Horst-Dieter Döricht
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April 2017
Zentralzylinder einer Wurzel der Weißen Fledermausblume (Tacca integrifolia) im Fluoreszenzkontrast von Dr. Horst Wörmann
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März 2017
Ausschnitt von einem Flügel der Großen Hausmücke (Culiseta annulata) von Frank Fox
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Februar 2017
Azurit aus Tsumeb (Namibia) von Horst-Dieter Döricht
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Januar 2017
Ein Süßwasserpolyp (Hydra spec.) von Frank Fox
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Dezember 2016
Farbpigmente der Smaragdzahl parallel zur Oberfläche auf der neuen 5-Euro-Note von Dr. Horst Wörmann
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November 2016
Spross der Eibe (Taxus spec.), Querschnitt in W3Asim II Färbung von Rolf-Dieter Müller
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Oktober 2016
Detail der neuen Fünfeuronote mit Mikroschrift im Stern, Aufnahme von Dr. Horst Wörmann
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September 2016
Die Walnuss-Fruchtfliege (Rhagoletis suavis), Aufnahme von Horst-Dieter Döricht.
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August 2016
Methylsulfonal-Kristalle, Aufnahme von Frank Fox.
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Juli 2016
Das Säulenglöckchen (Epistylis sp.) in seiner vollen Pracht. Aufnahme von Frank Fox.
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Juni 2016
Wasserspeicherzelle im Mesophyll des Zylindrischen Bogenhanfs (Sansevieria cylindrica), frischer Querschnitt gefärbt mit Toluidinblau. Aufnahme von Jörg Weiß.
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Mai 2016
Einaugen-Muschelkrebs (Cypria opthalmica) von Horst-Dieter Döricht
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April 2016
Fuß des Rüsselkäfers Eupholus linnei, Aufnahme von Frank Fox.
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März 2016
Frischer Schnitt eines Fiederdorns der Zwerg-Dattelpalme in der Primärfluoreszenz bei 365 nm Anregungswellenlänge, Aufnahme von Dr. Horst Wörmann.
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Februar 2016
SEM-Aufnahme eines Bärtierchens von Horst-Dieter Döricht
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Januar 2016
Elektrische Schaltkreise auf einem Chip im Auflicht DIC von Frank Fox
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Dezember 2015
Dunkelfeldaufnahme vom Grünen Trompetentierchen (Stentor polyxmorphus); Aufnahme von Frank Fox
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November 2015
Querschnitt durch das Blatt einer Welwitschie (Welwitschia mirabilis), Färbung W3Asim II; Aufnahme von Jörg Weiß
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Oktober 2015
Kopf einer Stechmückenlarve (Culex spec.) von Frank Fox
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September 2015
Das Lilienhähnchen (Liliceris lilli) von Horst-Dieter Döricht
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August 2015
Leitgewebe und Endodermis in der Wurzel des Muriel-Bambus (Fargesia murieliae). Foto von Jörg Weiß.
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Juli 2015
Schuppenhaare des Silbernen Grünrüsslers (Phyllobius argentatum). Foto von Horst-Dieter Döricht.
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Juni 2015
Wachstumskegel an der Sprossspitze der Weinrebe (Vitis vinifera) im Präparat von Bodo Braunstorfinger. Foto von Jörg Weiß.
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Mai 2015
Ein Reusen-Rädertier von Frank Fox
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April 2015
Die Diatomee Triceratium broeckii (Oamaru) in einer Aufnahme von Päule Heck
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März 2015
Uroleptopsis roscoviana, ein roter Cilliat, Aufnahme von Frank Fox
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Februar 2015
Drei Konidien des Echten Mehltaus auf einem Weizenblatt mit Keimschläuchen und Appressorien, Aufnahme von Jörg Weiß
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Januar 2015
Sklerenchymband im Spross der Kiwi (Actinidia deliciosa), Aufnahme von Jörg Weiß
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Dezember 2014
Die Diatomee Auliscus convolutus (Alen's Farm, Oamaru), Aufnahme von Päule Heck
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November 2014
Schale einer Diatomee im Interferenz-Phasenkontrast. Aufnahme von Frank Fox.
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Oktober 2014
Haare auf dem Brustpanzer einer Goldfliege (Lucilia sericata). Aufnahme von Horst-Dieter Döricht.
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September 2014
Stomagruben an der Blattunterseite eines frischen, unfixierten Schnittes des Oleanders (Nerium oleander) bei einer Vergrößerung von 200x. Aufnahme von Jörg Weiß.
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August 2014
Augen am Kopf einer Sprigspinne. Die Reflexe stammen von der Beleuchtung mit einem LED-Ringlicht. Aufnahme von Frank Fox.
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Juli 2014
Die Zieralge Micrasterias radians bei der Teilung. Aufnahme von Frank Fox.
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Juni 2014
Querschnitt durch einen siebenjährigen Spross des Chinesischen Blauregens (Wisteria sinensis, Durchmesser 21 mm) von Bodo Braunstorfinger. Aufnahme von Jörg Weiß
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Mai 2014
Männlicher Eibenzapfen (Taxus baccata) mit Pollen von Horst-Dieter Döricht
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April 2014
Spross des Efeus (Hedera helix) in W3Asim II - Färbung. Aufnahme mit einer Smartphone Kamera freihändig durch das Okular von einer Teilnehmerin der Lehrerfortbildung am Grotenbach Gymnasium Gummersbach.
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März 2014
Maritimer Fadenwurm im Polarisationskontrast von Frank Fox
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Februar 2014
Ungefärbter Querschnitt durch das Blatt des Pampasgrases (Cortaderia selloana) von Jörg Weiß
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Januar 2014
Parietin-Sublimation im freien Raum an Stahlwolle von Heike Buchmann
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Dezember 2013
Die Diatomee Hemiaulus proteus im Hellfeld von Päule Heck
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November 2013
Die Wimpernkugel Volvox aureus im Interphako von Frank Fox
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Oktober 2013
Zwei Algen der Art Micrasterias rotata, Aufnahme von Rudolf Krönung.
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September 2013
Rückenschild und Flügelansätze der Grünen Futterwanze, Aufnahme von Horst-Dieter Döricht
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August 2013
Mit W3Asim II gefärbter Querschnitt durch den Thallus eines Blasentangs (Fucus vesiculosus), Aufnahme von Jörg Weiß.
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Juli 2013
Gelbe Blattwespe (Nematus tibialis), Aufnahme von Horst-Dieter Döricht.
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Juni 2013
Gold in der lamellaren Verwachsung von Kupferkies (gelb) und Bornit (rotbraun). Grube Hohlestein an der Eisernhardt, Siegen. Aufnahme Prof. Holger Adelmann.
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Mai 2013
Spinnenfaden bei 1000-facher Vergrößerung im DIC. Präparation und Schwarzweiß-Aufnahme von Anton Berg.
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April 2013
Papyrus (Cyperus papyrus) ungefärbt in der Primärfluoreszenz. Präparation und Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
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März 2013
Diatomee im Interferenz-Phasenkontrast. Präparation und Aufnahme von Frank Fox.
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Februar 2013
Ungefärbter Querschnitt durch das Blatt einer Kamelie. Präparation und Aufnahme von Jörg Weiß.
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Januar 2013
Leitbündel aus dem Mittelstrang der Frucht eines Zitronenbaums (Citrus x limon). Das filigrane Präparat ist nur 7 µm dick und wurde von Anton Berg erstellt. Zum Vergleich: die meisten hier gezeigten botanischen Schnitte haben eine Dicke von ca. 50 µm. Aufnahme von Jörg Weiß.
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Dezember 2012
Anschliff einer Kohle aus der Grube Fürst Leopold in der Auflichtfluoreszenz; Anregung mit einer Wellenlänge von 470 nm. Aufnahme von Dr. Horst Wörmann.
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November 2012
Schwimmhaare auf der Blattoberseite eines tropischen Schwimmfarns aus der Familie Salvinia. Aufnahme von Frank Fox.
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Oktober 2012
Rezente Diatomee Bacteriastrum furcatum Shadbolt aus dem Golf von Thailand. Aufnahme von Päule Heck.
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September 2012
Die hier gezeigte Spaltöffnung aus Rhynie Chert Material ist 400 Millionen Jahre alt. Aufnahme von Holger Adelmann.
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August 2012
Eier einer Zuckmückenart (Chironomidae) im Phasenkontrast, Aufnahme von Frank Fox.
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Juli 2012
Porträt einer Frühen Adonislibelle (Pyrrhosoma nymphula), Aufnahme von Frank Fox.
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Juni 2012
Dünnschliff eines Quarzitschiefers aus den Italienischen Alpen, Dicke ca. 25 µm. Aufnahme von Holger Adelmann.
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Mai 2012
Tracheen im Xylem des Korallenbaums, Spross, Färbung W3Asim II, Vergrößerung 200x. Aufnahme von Jörg Weiß.
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April 2012
Porträt einer zwei Tage alten Fliegen. Aufnahme von Horst-Dieter Döricht.
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März 2012
Aus der Schmelze kristallisiertes Methylsulfonal im polarisierten Licht. Aufnahme von Frank Fox
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Februar 2012
Die Kieselalge Achnantes longipes. Aufnahme von Frank Fox
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Januar 2012
Primäres Xylem und Markparenchym aus dem Spross der Gewöhnlichen Jungfernrebe. Ungefärbtes Präparat, Aufnahme von Jörg Weiß.
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Dezember 2011
Flügelschuppen eines Großen Fuchses (Nymphalis polychloros) im Auflicht. Aufnahme Frank Fox.
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November 2011
'Dazu muss ich sagen, dass es mir nicht um irgendeine Form wissenschaftlicher Fotografie ging. Ich habe wilde Gemische hergestellt und dann nachgesehen, wie das Produkt aus sah. ... Genieß' das Spiel der Farben und Formen.' Aufnahme von Herne.
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Oktober 2011
Glockentierchen (Vorticellidae) im differenziellen Interferenzkontrast. Aufnahme von Frank Fox.
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September 2011
Die Radiolarie Hexacontium papillosum aus einem Präparat von Albert Elger. Aufnahme von Päule Heck.
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August 2011
Querschnitt durch den Spross des Gartenbambus (Fargesia murieliae). Vergrößerung 100x, Färbung W3Asim II. Aufnahme Jörg Weiß mit Leica C-Plan 10x an Leica DME. Kamera Canon PS A520.
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Juli 2011
Micrasterias rotata aus einer Wasserprobe von der Wuppertalsperre. Aufnahme Holger Adelmann mit der Moticam 2300 am Leitz Orthoplan mit 40er Plan Fluotar und DIC.
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Juni 2011
Bild 1
Angeschliffene Foraminifere aus einem Hydrobienkalk des Untermiozän. Fundort Dexheim bei Mainz. Präparation Fa. Krantz, Aufnahme Prof. Holger Adelmann.
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Juni 2011
Bild 2
Kopf mit Mundwerkzeugen und vorderes Körperdrittel einer nicht näher bestimmten Zuckmückenlarve (Chironomus sp.). Präparation und Aufnahme von Frank Fox.
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Mai 2011
Querschnitt vom Rollblatt des Strandhafers (Ammophila arenaria), Schnittdicke ca. 50 µm, Färbung Wacker W3A. Stitch aus 240 Einzelaufnahmen mit Zeiss Standard WL, Plan Apo 25x/0.65, Kamera Canon EOS 5D MK II mit Vollformat-Chip. Stitching mit Canon Photostitch.
Präparat von Jörg Weiß, Aufnahme von Joachim Schwanbeck.
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April 2011
Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Abdruck von der Blattunterseite, erstellt mit UHU Hart. Hellfeld.
Vergrößerung 200x, Länge des Bildausschnitts im Objekt ca. 0,5 mm. Aufnahme und Präparation von Jörg Weiß.
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März 2011
Auskristallisierte Mineralstoffe aus flüssigem Kunstdünger. Zeiss Jenamed mit Planapochromat 12,4x CF250, polarisiert mit Lambda-Platte, Einzelaufnahme mit Vollformat-Kamera Canon 5D Mark II.  Aufnahme und Präparation von Frank Fox.
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Februar 2011
Nadelquerschnitt der Schlangenhaut-Kiefer (Pinus heldreichii). Aufnahme und Präparation von Rolf-Dieter Müller, Stitch aus ca. 70 Einzelbilder. Schnittdicke 25 µm, Färbung Wacker W3A (Acridinrot, Acriflavin, Astrablau).
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Januar 2011
Achtung, großes Bild!
Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Leitbündel. Aufnahme von Prof. Holger Adelmann, Präparat von Jörg Weiß.
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Dezember 2010
Metapelit, Dicke ca. 25 µm, Präparation durch Willi Tschudin, Aufnahme von Dr. Horst Wörmann.
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November 2010
Simocephalus vetulus (Anomopoda), der Plattkopf- Wasserfloh. Aufnahme von Päule Heck.
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