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Eine einfache Schnittechnik zur schnellen Bestimmung von Torfmoosen

Der Referent Prof. Jahn-Peter Frahm mit in PEG eingeschmolzenem Untersuchungsmaterial auf einem Objektträger.
Prof. Jan-Peter Frahm und Rolf-Dieter Müller vom 17.03.2011

Die hier beschriebene Methode wurde im Rahmen des Monatstreffens des MKB vorgestellt und in der Praxis erprobt.
Zum Bestimmen von Torfmoosen (Spaghnum) sind Querschnitte von Astblättern, gelegentlich auch von Stämmchen, erforderlich. In den Astblättern ist die Form und Lage der chlorophyllhaltigen Zellen (Chlorocyten) zu ermitteln. Die Blätter sind – wie bei den meisten Moosen – einzellschichtig und haben eine Dicke von ca. 30-40 µm. Die Schnitte müssen also dünner als diese ca. 40  µm sein, damit der Schnitt möglichst nicht auf der falschen Seite zu liegen kommt.

Da nicht der Schnitt das Ziel der Arbeit ist sondern die Bestimmung der Art, verbieten sich langwierige Einbettungen. Die klassische Schneidemethode ist die mit Holundermark, die aber sehr viel Geschick erfordert. Man kann auch die Blätter oder Stämmchen in einen Tropfen Wasser auf den Objektträger legen, mit einer Nadel festhalten und unter dem Binokular mit einer Rasierklinge Schnitte führen. Oder auch einen Fingernagel zum Ansetzen der Klinge nehmen. Auch das erfordert viel Erfahrung und Geschick. Eine Alternative ist die Einbettung in Histowachs.
  • Das Untersuchungsobjekt: Sumpf-Torfmoos (Sphagnum papillosum), das Moos aus einer alten Probe aus Frankreich ist gänzlich ausgetrocknet.
  • Das Untersuchungsobjekt: Sumpf-Torfmoos (Sphagnum papillosum), das Moos aus einer alten Probe aus Frankreich ist gänzlich ausgetrocknet.
  • Das Untersuchungsobjekt: Sumpf-Torfmoos (Sphagnum papillosum), das Moos aus einer alten Probe aus Frankreich ist gänzlich ausgetrocknet.
Histowachs ist der deutsche Handelsname für Polyethylenglykol, welches Paraffin-artig ist, aber wasserlöslich. Es wird mit unterschiedlichen Schmelzpunkten zwischen 44° und 58° von der Fa. Chroma (jetzt Waldeck) vertrieben. Es wird in der Regel auch wie Paraffin benutzt (vgl. die Anleitung im Aufsatz "Ausgewählte Färbemethoden" von Chroma [1])

Dies ist für die Einbettung ähnlich umständlich und zeitraubend wie die Paraffin-Methode, hat aber den Vorteil, dass man die Schnitte zum Schluss in Wasser auswaschen kann. Eine einfachere Methode hat Felix Schumm für Flechten entwickelt. Sinngemäß lässt sich diese Methode auch für Torfmoose benutzen: man nimmt dann statt des Flechtentallus ein Torfmoosästchen zum Einbetten oder streift besser einzelne Blätter auf einen Objektträger, weil die Blätter am Ast schräg inseriert sind und das zu Schrägschnitten führen kann.


Eine Messerspitze Histowachs wird auf einen Objektträger gegeben und mit einem Feuerzeug zum Schmelzen gebracht. In das noch flüssige Histowachs drückt man ein ca 4 mm langes trockenes (!!) Thallusstückchen der zu schneidenden Flechte und wartet, bis das Wachs erkaltet ist. (Um das Abkühlen zu beschleunigen, kann man den Objektträger auf den Objekttisch des Mikroskops legen, wodurch die Wärme rasch abgeleitet wird). Dann schneidet man mit einer ggf. halbierten Rasierklinge, am besten unter dem Binokular, dünnste Scheibchen ab. Die Schnitte werden mit dem Skalpell oder ähnlichem direkt auf einen anderen Objektträger in einen Tropfen Wasser übertragen. Das Histowachs löst sich in Wasser auf, und man kann die Schnitte nach Auflegen eines Deckgläschens sofort untersuchen. [2]
Das eingegossene Sphagnum-Ästchen ist fertig zum Schnitt - dieser erfolgt zur besseren Kontrolle unter dem Stereomikroskop.
Der eigentliche Trick bei dieser Methode und der Unterschied zu den klassischen Rezepten ist, dass das Pflanzenmaterial trocken ist. Nur dann kann man sofort schneiden. Feuchtes Material müsste man 24h austrocknen lassen. Mike Guwak hat im Mikroskopieforum eine Methode beschrieben, bei der man das Pflanzenmaterial für 24h in eine 20% wässrige Lösung von Histowachs einlegt und das Wasser verdunsten lässt. Das verzögert die Bestimmung des Torfmooses um einen Tag. Er beschreibt aber sehr schön die Schnittechnik:

Dann beginnt das Schneiden unter dem Stereomikroskop. Den linken Zeigefinger legt man dazu auf das Objekt und schneidet dann mit der Rasierklinge entlang der Fingerkuppe einmal großzügig einen Streifen ab. Dann hat man eine gerade Schnittkante und von dort aus beginnt man. Wenn man jetzt den linken Zeigefinger ein wenig zurück nimmt oder die Rasierklinge etwas fester an die Fingerkuppe drückt, erhält man einen ersten Schnitt. Etwas Übung braucht man schon und mit der Zeit entwickelt sich ein motorisches Feingefühl, das zu hinreichend dünnen Schnitten führt. [3]

Nach dem Schneiden entfernt man die gröberen Histowachs-Partikel mit einer Pinzette und tropft nach Auflegen eines Deckglases Wasser auf die Schnitte. Das restliche Histowachs löst sich dann auf und das Deckglas verhindert oft, dass ggf. etwas zu dick geratene Schnitte auf die falsche Seite kippen.
  • Bereit zur Einbettung:  ein Moosästchens (nimmt man einzelne Blätter, verringert sich die Gefahr schräger Schnitte) auf dem Objektträger. Aufnahme von Jörg Weiß.
  • Einige Blättchen niedrig schmelzendes PEG (44 bis 48°C) dazu geben ...  . Aufnahme von Jörg Weiß.
  • ... und über einem Brenner oder einer Feuerzeugflamme kurz erwärmen . Aufnahme von Jörg Weiß.
  • Das PEG schmilzt und umschließt die Probe. Aufnahme von Jörg Weiß.
  • Es dauert nicht lange, und das PEG beginnt wieder auszuhärten. Aufnahme von Jörg Weiß.
  • Das PEG ist wieder erhärtet und die Probe bereit zum Schneiden. Aufnahme von Jörg Weiß.
  • Der Schnitt erfolgt zur besseren Kontrolle der Schnittführung unter dem Stereomikroskop. Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
  • Blick durchs Okular auf die angeschnittene Probe. Aufnahme von Jörg Weiß.
  • Ein neuer Schnitt entsteht. Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
  • Oberhalb der eingegossenen Probe liegen einige fertige Schnitte. Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
Ein ganzes Mossblättchen von Sphagnum papillosum gefärbt mit Etzold Grün nach Brügmann im Durchlicht. Vergrößerung 400x, Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
Da die Torfmoosblättchen selbst kaum Eigenfärbung haben, muss man sie, besonders aber die Schnitte, kontrastieren. Speziell sind die bestimmungswichtigen Löcher (Poren) in den Zellwänden in ihrer Anordnung, Größe und Art sonst kaum sichtbar. Das kann mit optischen Methoden (Interferenzkontrast) geschehen, als auch einfacher durch Anfärbung. Geeignet sind alle Totalfärbungen, egal mit welcher Farbe.

Man kann daher Methylenblau verwenden (was zumeist empfohlen wird), aber auch Brillantkresylblau (BKB), Methylviolett, Eosin, Kernechtgrün u.a.

Eine preiswerte Alternative bieten selbst erstellte Totalfärbemittel. Dazu nimmt man leer geschriebene Kugelschreiberminen, zerschneidet diese in 2 cm lange Stücke, welche in eine Petrischale mit Ethanol oder Spiritus gelegt werden. Die restliche Minenfüllung löst sich dann und ergibt eine Farblösung, die abgegossen werden kann.

Die Farblösungen saugt man am besten unter das Deckglas, weil die dünnen Schnitte zu zart zum Umbetten sind. Noch einfacher ist die Verwendung eines Kopierstiftes. Man tunkt dazu die Minenspitze in den Wassertropfen mit den Schnitten, wobei sich der Minenfarbstoff löst und die Schnitte anfärbt.
  • Ein Stämmchen von Sphagnum papillosum im Querschnitt. Ungfärbt, Vergrößerung 400x. Präparat und Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
  • Querschnitt eines Blättchens von Sphagnum papillosum, gefärbt mit BKB (Brillantkresylblau), charakteristisch sind die hier gut sichtbaren Papillen an den Außenseiten der Chlorocyten. Vergrößerung 400x. Präparat von Jörg Weiß, Aufnahme von Rolf-Dieter Müller.
  • Ein Torfmoosblatt in der Übersicht. Gut zu erkennen sind die bestimmungsrelevanten Öffnungen der Speicherzellen (Hyalinzellen). Färbung Methylenblau, Vergrößerung 200x. Präparat und Aufnahme Jahn-Peter Frahm.
  • Färbeproben mit unterschiedlichen Farbstoffen. Aufnahme Rolf-Dieter Müller.
Um langwieriges Entwässern zu vermeiden, verwendet man am besten ein wasserlösliches Einschlussmedium. Früher wurde die flache Aufbewahrung in Glyzerin, Einbettung in Glyceringelatine, Hoyers Medium o.ä. empfohlen. Heute gibt es eine Vielzahl von wasserlöslichen Produkten (Merck Aquatex, Microtech Hydromatrix u.a.).
Da – wie erwähnt – Schnitte eine Umbettung schlecht vertragen, kann man das Einschlussmedium unter dem Deckglas hindurch ziehen. Dazu gibt man mit einer kleinen 25 ml Spritzflasche an einem Rande des Deckglases einen Streifen des Einschlussmediums. Der Streifen muss der Kante des Deckglases anliegen, darf aber nicht auf die Oberfläche kommen. Wenn das Wasser im Präparat nun zu den drei offenen Seiten verdunstet, wird das Einschlussmedium nachgesogen. Die richtige Menge muss man in eigener Erfahrung ausprobieren: ist es zu wenig, wandert es nicht ganz durch das Präparat.

Durch die hier beschriebene Methode verkürzt sich das Einbetten auf wenige Sekunden. Man braucht keinerlei Vorbereitungen und kann jederzeit entscheiden, ob man das Präparat verwirft oder durch einen Streifen Einschlussmittel konserviert. Der Objektträger muss dann einige Tage flach aufbewahrt werden um auszuhärten, bevor er beschriftet und aufrecht gestellt werden kann.
Literatur
[1]  Ausgewählte Färbemethoden für Botanik, Parasitologie und Zoologie
      Chroma, Münster 2003, S. 9 ff.

[2]  Mitteilungen der Mikro AG
      Stuttgart, September 1990, Heft 3

[3]  Wie schneide ich ein Moosblatt?
      Mike Guwak, Mikroskopie-Forum.de, März 2009

Text: Prof. Jahn-Peter Frahm
Aufnahmen: Prof. Jahn-Peter Frahm, Rolf-Dieter Müller, Jörg Weiß
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Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Leitbündel. Aufnahme von Prof. Holger Adelmann, Präparat von Jörg Weiß.
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