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Botanische Schnitte mit dem Hand-Zylindermikrotom

Um solche dünnen Schnitte zur Betrachtung unter dem Durchlichtmikroskop herzustellen, benötigt man ein Mikrotom (Besenheide - Calluna vulgaris - Vergrößerung 50x, Färbung Wacker W3A).
Jörg Weiß, vom 16.09.2011

Mit dem Stereomikroskop kann man im Auflicht wunderbar die Strukturen z.B. eines Blattes untersuchen. Legt man dieses jedoch unter ein klassisches Durchlicht-Mikroskop, so erkennt man bestenfalls verschwommene Umrisse auf einer milchig grünen Fläche. Das Blatt als ganzes ist zu dick, um im Durchlicht betrachtet werden zu können.
Um Erfolg zu haben, müssen also Schnitte von dem Blatt erstellt werden, die dünn genug sind, um genügend Licht für die Beobachtung hindurch zu lassen (max. bis etwa 70µm) und dick genug, um die Zellverbände noch erkennen und deuten zu können (min. bis etwa 7 µm). Die optimale Schnittdicke ist dabei von der Probe abhängig. Histologische Schnitte tierischer und menschlicher Gewebe sind wesentlich dünner (5 µm bis hinunter zu 70 bis 100nm), da die zu beobachteten Zellen entsprechend kleiner sind.
Ein frühes Mikrotom von Cummings, etwa 1774. Aus dem Journal of the Royal Microscopical Society, 1910. Quelle: Mirco Junge, Wikipedia.
Ein Mikrotom ist ein Gerät zum Erstellen solch dünner Schnitte für mikroskopische Unter- suchungen im Durchlicht. Der Name kommt aus dem Griechischen von "mikros" (klein) und "temnein" (schneiden). Für unterschiedliche Zwecke und Materialien wurden die unterschiedlichsten Mikrotomtypen entwickelt (Ultra-Mikrotom, Rotationsmikrotom, Schlitten- mikrotom, Zylindermikrotom und Kastenmikrotom). Teilweise handelt es sich dabei um sehr aufwendige und entsprechend teuere Geräte, die nur in professionellen Laboren zu finden sind. Andere sind auch an den Arbeitsplätzen der Hobby-Mikroskopiker anzutreffen.
Das im Kreis der Hobbyisten am weitesten verbreitete Mikrotom ist das Hand-Zylin- dermikrotom, dessen Bauform auf erste Entwürfe von Georg Adams (1770) zurück geht.
Bau und Funktion des Hand-Zylindermikrotoms
Ein Hand-Zylindermikrotom mit Zubehör, wie im Artikel beschrieben.
Das Zylindermikrotom schiebt die Probe mittels einer Mikrometerschraube über einen Stempel oder eine Klemmvorrichtung durch das Mittelloch einer Glasplatte, die als Messerführung dient. Der überstehende Teil der Probe kann dann mit einem geeigneten Messer (dazu später mehr) abgeschnitten und weiter präpariert werden.
Je nach Probe, Vorbereitung und Geschick sind Schnittdicken zwischen 70 und etwa 20 µm erreichbar, was für botanische Schnitte in aller Regel ausreichen dünn ist.
Zylindermikrotome gibt es in verschiedenen Bauformen. Am praktischsten sind Tischmikrotome, deren Mechanik auf einem schweren Fuß montiert ist, so dass mit ihnen frei stehend auf der Arbeitsplatte geschnitten werden kann. Die einfacheren Geräte werden in der Regel mit einer entsprechenden Klemme an der Tischkante befestigt, um beim Schneiden beide Hände frei zu haben. Im einfachsten Fall hält die eine Hand das Mikrotom und die andere führt das Messer. Auch so sind gute Schnitte möglich, da diese in aller Regel auf das Messer aufziehen und nicht unbedingt mit einem Pinsel gestützt werden müssen.
  • Ein einfaches Hand-Zylindermikrotom mit Klemme. Dies erkennt man an der nach außen geführten Rändelschraube.
  • In der zentralen Bohrung erkennt man die Backen der Klemmvorrichtung.
  • Mikrometerschraube mit Skala zum Vorschub der Probe. Vor jedem Schnitt muss die Schraube um die gewünschte Anzahl Teilstriche weiter gedreht werden. Ein Teilstrich entspricht in der Regel 10 µm.
  • Ein Tisch-Zylindermikrotom mit eingespannter Probe und Klingenhalter. Aufnahme Eckhard Völcker.
Die nur mit einem einfachen Stempel ausgerüsteten Zylindermikrotome sind ausschließlich zur Verarbeitung von Paraffin-Blöcken geeignet, die auf diesen aufgeschmolzen werden. Die Paraffin-Präparation ist ein recht aufwändiger Vorgang und zum Schneiden solcher Blöcke empfiehlt sich ein Rotationsmikrotom, mit dem dünnere Schnitte in Bändern erstellt werden können.
Bei der Anschaffung eines Handzylindermikrotoms sollte also darauf geachtet werden, dass eine Klemme vorhanden ist, die die Probe selbst oder mit einer entsprechenden Umschließung sicher hält. Zylindermikrotome mit Klemme erkennt man an der durch den Zylinder nach außen geführten Rändelschraube zur Feststellung der Klemme.
Das Messer
Fertig montierter Klingenhalter nach Herrmann, Kramer und Streble.
Zum Schneiden kann man verschiedene Messer verwenden, die frei geführt werden müssen - die Schnittbahn ist also nicht wie beim Kastenmikrotom fest vorgegeben. Gute Ergebnisse erzielt man mit einem speziell für den Mikrotomschnitt geschliffenen Rasiermesser, das je nach dem, ob es mit der linken oder rechten Hand geführt werden soll, auf einer Seite plan geschliffen ist (die andere Seite hat in aller Regel einen Hohlschliff). Die Pflege solcher Messer ist etwas aufwändiger (siehe hierzu Rudolph Krönungs hervorrangende Anleitung "Abenteuer Klingen Schärfen", die auf der Webseite des MKB heruntergeladen werden kann [1]), aber sie lohnt sich, da mit der langen, direkt über die Glasplatte geführten Klinge beste Schnitte gelingen, wenn diese gut geschliffen und frisch abgezogen ist.
Hier möchte ich aber näher auf den Schnitt mit handelsüblichen Einmalklingen eingehen, die in einem Messerhalter geführt werden. Die Klingen müssen nicht gepflegt werden und sind in 50er-Packungen im Laborfachhandel erhältlich (z.B. Leica 110143 - auf die breite Bauform achten). Der Klingenhalter wurde von den engagierten Mikroskopikern Hr. Herrmann, Hr. Kramer und Hr. Streble entworfen (SHK - Klingenhalter) und weiter entwickelt [2]. Er kann über Hr. Dr. Detlef Kramer (Kontakt über das Mikro-Forum von Christian Linkenheld) bezogen werden.
Es handelt sich dabei um zwei Aluminiumprofile, zwischen die die Einmalklinge mittels zweier Rändelschrauben geklemmt wird und durch deren Form der korrekte Schnittwinkel bereits fest vorgegeben ist. Am unteren Profil befindet sich ein Teflon-Gleiter, der eine saubere Führung über die Glasplatte des Zylindermikrotoms sicher stellt. Ein kleiner Nachteil soll dabei nicht verschwiegen werden: durch den Gleiter liegt der Schnitt mit dem Messerhalter um ca. 2 mm über der Glasplatte, was beim Schneiden freistehender Proben beachtet werden muss.
Das Einlegen der Klinge in den Messerhalter
  • Eine Einmalklinge vor dem Klingenspender, Leica Modell 110143.
  • Die Klinge
  • Alles bereit zum Einsetzen der Klinge.
  • Die Klinge muss an der eingefrästen Kante der Unterschale des Klingenhalters anliegen.
  • Dann wird die Oberschale aufgelegt und mit den Rändelschrauben handfest angezogen. Fertig zum Einsatz!
Die bei manchen Zylindermikrotomen mitgelieferten, aus einem Stück geschmiedeten Messer sind unbrauchbar. Die Klingen sind zu kurz und sie lassen sich wegen der Kante zwischen Griff und Schneide nicht vernünftig schleifen und abziehen.
Vorbereitung der Probe
Mit dem Hand-Zylindermikrotom können sowohl frische als auch fixierte Proben geschnitten werden. Frischmaterial sollte sehr zeitnah vor dem Schnitt entnommen und möglichst sofort verarbeitet werden.
Die Fixierung botanischer Proben erfolgt am besten mit der klassischen AFE Lösung (für 100 ml Ansatz 90 ml Ethanol 70%, 5ml Essigsäure 98% und 5ml Formaldehyd 35%). Aushilfsweise kann auch mit Ethanol 70% fixiert werden. Die Fixierung sollte sofort nach der Probenahme erfolgen. Dazu werden mit einer scharfen Rasierklinge oder einem Skalpell etwa 10 bis 15 mm lange Stücke geschnitten und diese mit reichlich Fixierlösung bedeckt. Eine Arbeitsblatt zur Probenvorbereitung kann auf der Webseite des MKB herunter geladen werden [3].
Stabile Sprossstücke können frei stehend in den Klemmmechanismus des Zylindermikrotoms eingespannt werden. Dabei ist darauf zu achten, dass diese senkrecht zur Schnittfläche stehen, um schräge Schnitte durch die Zellagen zu vermeiden, was besonders bei den Tracheen der Leitbündel zu unschönen Effekten führen würde.
Die Probe muss dabei so fest eingespannt sein, dass sie dem Messer nicht ausweichen kann, allerdings darf sie auch nicht zu sehr gequetscht werden. Für den frei stehenden Schnitt eignen sich Sprosse von Gehölzen und Sträuchern sowie manche stabile Blattstiele wie z.B. von Walnuss und Platane.
Freistehend eingespanntes Sprosstück bereit zum Anschnitt.
Freistehend eingespanntes Sprosstück bereit zum Anschnitt.
Weniger stabile Proben müssen geeignet umschlossen werden. Dazu kann ganz klassisch Holundermark verwendet werden, das aber nur einen trockenen Schnitt erlaubt. Befeuchtet man Holundermark mit Ethanol, verliert es seine Festigkeit und kann die umschlossene Probe nicht mehr stützen.
Bestens geeignet sind Möhren (Karotten), die passend in Form geschnitten werden können. Dazu und zum Zuschneiden der Probe selbst verwendet man am besten die Einmalklinge vom letzten Schnitt.
Sprossstücke, Wurzeln oder Blattstiele - also alle runden Proben - steckt man am einfachsten in ein passendes Loch, das man mit einem Zahnstocher oder einem Holzspießchen in das Möhrenstück gestochen hat.
Dazu schneidet man zunächst ein etwa 20 mm langes Stück aus einer möglichst gerade gewachsenen Möhre heraus und achtet auf parallele und senkrecht zur Achse der Möhre stehende Schnitte.
Dieser Möhrenzylinder wird nun passend zur Probe in der Mitte senkrecht durchstochen. Dabei sollte das Loch einen geringfügig kleineren Durchmesser als die zu umschließende Probe haben, damit diese sicher und fest gehalten wird. Bei dickeren Proben kann man sich auch mit einem Holzbohrer oder einem Satz Korkbohrer behelfen. In das so entstandene Loch wird nun die Probe eingesteckt.
Erst jetzt wird der Möhrenzylinder passend quadratisch zurecht geschnitten. Dabei sollte zu allen Seiten der Probe noch mindestens 2mm Möhre stehen bleiben. Der Durchmesser ist somit abhängig von der Bohrung des Zylindermikrotoms, dessen Klemmmechanismus und der Dicke der Probe.
In zwei Möhrenbacken eingeschlossenes Blattstück bereit zum Anschnitt.
Auch flache Proben, wie das eingangs erwähnte Blatt, können so eingespannt werden. Dazu wird ein passender Möhrenblock, der den Zentralzylinder beinhalten sollte, einmal quer durchgeschnitten. Auch hier ist auf eine genau Senkrechte Schnittführung zu achten. Die beiden Hälften lässt man ein wenig antrocknen (vorbereiten!) und legt sie dann umgekehrt zusammen. Durch die unterschiedliche Verdunstung aus dem Zentralzylinder und dem umgebenden Speichergewebe der Möhre entsteht eine leichte Wölbung. Somit kann das Blatt optimal geklemmt werden, ohne es zu quetschen und auch nach vielen Schnitten wird es noch sicher gehalten.

Egal ob Spross oder Blatt: zum Abschluss der Vorbereitung und unmittelbar vor dem Einspannen in das Mikrotom wird die spätere Schnittfläche mit der Einmalklinge möglichst eben abgeschnitten, um später einen leichten Anschnitt zu ermöglichen.

Zur Umschließung der Probe kann in gleicher Weise auch Styrodur oder ein anderer Hartschaum aus dem Baumarkt verwendet werden. Bei der Verwendung eines Hartschaums leidet die Klinge jedoch, was zu kürzeren Standzeiten führt.
Eine bebilderte Anleitung der hier geschilderten Methode finden Sie hier auf unserer Seite.
Vorbereitung des Mikrotoms und des Messers
Die Probe oder das Möhrenblöckchen wird nun in der Klemme des Mikrotoms fest und genau senkrecht zur Glasfläche eingespannt und die Schnittfläche mit Ethanol 70 % befeuchtet.
In den Klingenhalter kommt eine frische Einmalklinge, die ebenfalls großzügig mit Ethanol 70% angefeuchtet wird.
Der Schnitt
Beim Schnitt wird das Messer oder der Messerhalter ziehend mit wenig Druck durch die Probe geführt. Durch das Ethanol zieht der dünne Schnitt (ggf. mit umgebendem Möhrengewebe) auf die Klinge auf und kann mit einem Pinsel abgenommen und in ein Vorratsgefäß mit Ethanol 70% gegeben werden.
Vor jedem nächsten Schnitt müssen Anschnitt und Klinge wieder gut mit Ethanol befeuchtet werden.
Ziehend schneiden und nicht zu stark andrücken.
Ziehend schneiden und nicht zu stark andrücken.
Zunächst fährt man die Probe mit der Mikrometerschraube in 100 µm - Schritten nach oben (dies entspricht in der Regel 10 Teilstrichen auf der Skala) und führt einen Schnitt durch. Die ersten Schnitte gehen vielleicht noch ins Leere und nach einigen Keilen erhält man parallele Schnitte der kompletten Probe. Nun ist der Anschnitt abgeschlossen.

Für die folgenden Schnitte wird der Vorschub nun jeweils um die gewünschte Schnittdicke, z.B. 50 µm oder 30 µm, eingestellt und das Messer in der beschriebenen Weise mit leichten Andruck über den Glasteller geführt. Die Schnitte ziehen auf den Messerrücken bzw. den Halter auf und können von dort mit einem ethanolfeuchten Pinsel abgenommen und in das bereitstehende Gefäß (s.B. ein Uhrglas) mit Ethanol übernommen werden. 
Achtung:
Da der Schnitt oberhalb des Teflongleiters erfolgt, muss darauf geachtet werden, dass der über die Glasplatte vorstehende Teil der Probe nicht mit diesem in Berührung kommt. Um die Schnittführung zu erleichtern, besitzt der Gleiter in der Mitte ein rechteckige Aussparung. An den Kanten dieser Aussparung ist die Gefahr, anzustoßen, am größten.
Wurde die Probe beim Schnitt doch berührt und eventuell verschoben, so muss sie wieder gerade eingespannt und neu in 100 µm - Schritten angeschnitten werden.
Unterseite des Klingenhalters mit dem Teflongleiter. Die Aussparung in der Mitte ist gut zu erkennen.
Unterseite des Klingenhalters mit dem Teflongleiter. Die Aussparung in der Mitte ist gut zu erkennen.
Nicht vergessen: Vor jedem Schnitt die Anschnittfläche und das Messer reichlich mit Ethanol befeuchten. Viel Erfolg!
Literatur
[1]  Abenteuer Klingen Schärfen
      Rudolf Krönung, 2010
      Dowload auf der Webseite des MKB

[2]  Perfekte Handschnitte mit einfachen Mitteln
      Klaus Herrmann und Heinz Streble
      Mikrokosmos 94, Heft 5/2005, Seite 269 ff.

[3]  Fixieren, Aufbewahren, Schnitte vorbereiten
      Arbeitsanleitung von Rolf-Dieter Müller
      Download auf der Webseite des MKB

[4]  Schneiden mit dem Zylindermikrotom
      Vortrag von Jörg Weiß
      Download auf der Webseite des MKB
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