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W3Asim II im Vergleich - Methoden und Ergebnisse

Bild 1: W3Asim II im Vergleich
Jörg Weiß, vom 01.03.2014

Viele Leser kennen sicher den Artikel zu den W3Asim - Fär- bungen [1] von Rolf-Dieter Müller weiter unten hier in der Bibliothek Botanische Mikrotechnik. Die Variante W3Asim I ist mit Astra- blau angesetzt und ähnelt von den Farbstoffen und der Farbwirkung her der original W3A Färbung von Robin Wacker - nur dass sie in einem simultanen Färbegang genau so einfach zu erstellen ist, wie die Färbungen der Etzold-Familie.
In der W3Asim II Färbung kommt hingegen - bei ansonsten gleichen Bestandteilen und ebenso einfacher Anwendung - der Farbstoff Alcianblau zum Einsatz. Hier geht die Farbwirkung eher ins Grünliche. Mit dieser zweiten Variante möchte ich mich heute beschäftigen.

Für W3Asim II gibt es drei Stammlösungen für die 3 Farbstoffe Alcianblau, Acriflavin und Acridinrot, die zur Herstellung der Färbelösungen dienen. Dabei sind die fertigen Färbelösungen genau so stabil, wie die Stammlösungen, sodass diese mit den entsprechenden Mengen auch direkt angesetzt werden können.
1007-information Die Rezepte zu den Stammlösungen
 
Das Thymol dient der Stabilisierung und erhöht die Haltbarkeit, da die Lösungen nicht so schnell verpilzen.

  • Alcianblau 0,2%
    - 0,2 g Alcianblau
    - Einige Kristalle Thymol
    - 2 ml Essigsäure 99%
    - 98 ml Aqau dest.
    Alcianblau löst sich relativ schlecht in Wasser.
  • Acriflavin 1%
    - 1,0 g Acriflavin (Chroma)
    - Einige Kristalle Thymol
    - 2 ml Essigsäure 99%
    - 98 ml Aqau dest.
  • Acridinrot 1%
    - 1,0g Acridinrot (Chroma)
    - Einige Kristalle Thymol
    - 2 ml Essigsäure 99%
    - 98 ml Ethanol 50%

Die Farbstoffe werden am besten in die sauberen und trockenen Aufbewahrungsflaschen der Stammlösungen eingewogen (Tara-Funktion der Waage). Anschließend erfolgt die Zugabe des Wassers bzw. des Ethanols und der Essigsäure. Dann dicht verschließen und gut schütteln. Anschließend kann das Thymol zugegeben werden. In den nächsten Stunden mehrmals gut umschütteln, bis die Farbstoffe komplett gelöst sind. Filtern erübrigt sich nach meiner Erfahrung.

Rolf-Dieter Müller hat in seinem Artikel ausgehend von den Stammlösungen zwei Rezepte für die Zusammensetzung der Färbelösung angegeben, von denen das zweite einen deutlich erhöhten Anteil an Alcianblau enthält und von ihm für frische, Schnittfixierte Präparate vorgesehen ist. Hier die zugehörigen Rezepte, die nachher bei den Testfärbungen zur Anwendung kommen.
1007-information Ansatz 1 - W3Asim II
 
Diese Mischung verwende ich regelmäßig in meinen Färbungen, ich nenne sie wie bisher einfach W3Asim II.

-  120 ml Aqua dest,
-   80 ml Alcianblau 0,2%,
-   20 ml Acridinrot 1,0%,
-   20 ml Acriflavin 1,0%
Ergeben 240 ml Farblösung. Das Verhältnis ist 6:4:1:1 - falls jemand 240 ml zu viel sein sollten.

1007-information Ansatz 2 - Asim II
 
Diese Mischung hat Klaus Herrmann dieser Tage auf Basis von Rolf-Dieter Müllers Vorschrift frisch angesetzt und beim Workshop in Darmstadt vorgestellt, wo wir sie gleich ausprobiert haben.
Zur Unterscheidung vom W3Asim II hat er sie Asim II getauft und ich verwende den Namen hier gerne weiter.

- 90,0 ml Alcianblau 0,2%,
-  5,0 ml Acridinrot 1,0%,
-  3,5 ml Acriflavin 1,0%,
-  1,0 ml Essigsäure 99%
Ergeben rund 100 ml Farblösung.

Wie unterscheiden sich nun die beiden Lösungen? Das sehen wir uns nun ein wenig genauer an. Klaus hatte die Probe bereits an Schnitten der Korea-Tanne (Abies koreana) durchgeführt und war so freundlich, seine Testpräparat mit mir zu tauschen. Somit hätten wir ein Beispiel für eine Gymnosperme.
Nun also noch eine Angiosperme. Da ich meinen eigenen W3Asim II Ansatz Ende letzten Jahres an Sprossquerschnitten des Chinesischen Blauregens (Wisteria sinensis, eine Beschreibung findet sich hier) getestet habe und Bodo Braunstorfinger so freundlich war, mir reichlich von seinen 30µm - Schnitten in Ethanol zu überlassen, bietet sich hier eine gute Möglichkeit, mit dem gleichen Material zu testen und auf die bereits erstellten W3Asim II - Präparate zurück zu greifen.

Die verwendeten Sprossquerschnitten - mit Beschriftung

  • Bild 1: Korea-Tanne, Spross quer, Periderm, ASIM II heiß mit Beschriftung
  • Bild 2: Korea-Tanne, Spross quer, Leitgewebe, ASIM II heiß mit Beschriftung
  • Bild 3: Chinesischer Blauregen, Spross quer Übersicht, W3Asim II kalt mit Beschriftung
Die Bearbeitung der Schnitte für die Testreihen folgt den bekannten Vor- schriften und ist für alle Proben identisch:

- Fixierung in AFE
- Spülen und ggf. Lagern in Ethanol 70%
- Vor dem Färben schrittweises Überführen in Aqua dest.

- Färbung nach einer der unten beschriebenen Methoden

- Nach dem Färben gründliches Spülen  mit Aqua dest.
- Entwässern in Isopropanol 100%
- Eindecken in Euparal

Ein Bleichen (Eau de Javele oder Klorix 1:4) oder Differenzieren (Salzsäure-Alkohol, Stufenweises Entwässern über Ethanol oder einfach nur längere Liegezeiten in reichlich Aqua dest.) war hier nicht notwendig und wurde auch nicht durchgeführt. Beide Arbeitsschritte haben natürlich ebenfalls Auswirkungen auf die Farbwirkung.

Der Vergleich

Die folgenden Färbevorschriften werden nun miteinander verglichen:

1. W3Asim II für 7 Minuten ohne Erwärmen (W3Asim II kalt)
2. Asim II für 20 Minuten ohne Erwärmen (Asim II lang)
3. Asim II für 5 Minuten mit einmaligem Erwärmen (bei Klaus auf 50°C, bei mir bis kurz vor dem Sieden - Asim II heiß)

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt zunächst in einem Übersichtsbild mit allen drei Varianten, immer in der oben beschrieben Reihenfolge (1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß) von links nach rechts bzw. von oben nach unten. Darunter finden Sie jeweils eine kleine Galerie mit den kompletten Aufnahmen zu den Färbungen.

Zunächst die Korea Tanne

Die Präparate, die den folgenden Bildern zugrunde liegen, stammen von Klaus Herrmann.
Kollenchym und Periderm der Korea Tanne
Bild 4: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß.
Das Periderm nimmt von links nach rechts immer weniger Farbe an, interessant, dass dies sogar für die erhitzte Probe ganz rechts gilt. Im Kollenchym ist eine Veränderung vom grünlichen ins bläuliche zu erkennen.
Bild 4: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß. Das Periderm nimmt von links nach rechts immer weniger Farbe an, interessant, dass dies sogar für die erhitzte Probe ganz rechts gilt. Im Kollenchym ist eine Veränderung vom grünlichen ins bläuliche zu erkennen.
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 5: Kollenchym und Periderm der Korea-Tanne, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 6: Kollenchym und Periderm der Korea-Tanne, 2. Asim II lang
  • Bild 7: Kollenchym und Periderm der Korea-Tanne, 3. Asim II heiß
Xylem, Cambium und Phloem der Korea-Tanne
Bild 8: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß  
Spannend: hier ist das Xylem sowohl beim W3Asim II als auch beim erhitzten Asim II magentafarben, bei langer Farbeinwirkung (Asim II lang) spielt der Farbton eher ins Orange. Die anderen Gewebe zeigen den gleichen Trend von grün nach blau wie das Kollenchym in Bild 4.
Bild 8: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß Spannend: hier ist das Xylem sowohl beim W3Asim II als auch beim erhitzten Asim II magentafarben, bei langer Farbeinwirkung (Asim II lang) spielt der Farbton eher ins Orange. Die anderen Gewebe zeigen den gleichen Trend von grün nach blau wie das Kollenchym in Bild 4.
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 9: Xylem, Cambium und Phloem der Korea-Tanne, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 10: Xylem, Cambium und Phloem der Korea-Tanne, 2. Asim II lang
  • Bild 11: Xylem, Cambium und Phloem der Korea-Tanne, 3. Asim II heiß

Und nun der Chinesische Blauregen

Hier stammen die Schnitte von Bodo Braunstorfinger und die Präparation vom Autor des vorliegenden Artikels.
Sprossquerschnitt des Chinesischen Blauregens in der Übersicht
Bild 12: Von oben nach unten: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß 
Hier ist der Unterschied zwischen dem W3Asim II und den beiden Asim II - Varianten deutlich größer, als bei der Korea-Tanne!
Einfach charakterisiert kann man sagen: W3Asim II kalt: grün-orange; Asim II lang: blau-orange und Asim II heiß: blau-magenta.
Bild 12: Von oben nach unten: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß Hier ist der Unterschied zwischen dem W3Asim II und den beiden Asim II - Varianten deutlich größer, als bei der Korea-Tanne! Einfach charakterisiert kann man sagen: W3Asim II kalt: grün-orange; Asim II lang: blau-orange und Asim II heiß: blau-magenta.
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 13: Sprossquerschnitt des Chinesischen Blauregens in der Übersicht, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 14: Sprossquerschnitt des Chinesischen Blauregens in der Übersicht, 2. Asim II lang
  • Bild 15: Sprossquerschnitt des Chinesischen Blauregens in der Übersicht, 3. Asim II heiß
Der chinesische Blauregen zeigt in seinen Sprossquerschnitt vielen Details, insbesondere das Xylem ist mit seinen dickwandigen Tracheen, des großen Hoftüpfeln und den unterschiedlichen Geweben des Xylemparenchyms hervorzuheben. Es lohnt sich also, genauer hin zu sehen: wir fangen beim Markparenchym an und arbeiten uns zum Periderm vor.
Markparenchym des Chinesischen Blauregens
Bild 16: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Bild 16: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 17: Markparenchym des Chinesischen Blauregens, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 18: Markparenchym des Chinesischen Blauregens, 2. W3Asim II lang
  • Bild 19: Markparenchym des Chinesischen Blauregens, 3. W3Asim II heiß
Primäres Xylem des Chinesischen Blauregens
Bild 20: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Bild 20: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 21: Primäres Xylem des Chinesischen Blauregens, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 22: Primäres Xylem des Chinesischen Blauregens, 2. W3Asim II lang
  • Bild 23: Primäres Xylem des Chinesischen Blauregens, 3. W3Asim II heiß
Xylem und Tracheen des Chinesischen Blauregens
Bild 24: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Bild 24: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 25: Xylem und Tracheen des Chinesischen Blauregens, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 26: Xylem und Tracheen des Chinesischen Blauregens, 2. Asim II lang
  • Bild 27: Xylem und Tracheen des Chinesischen Blauregens, 3. Asim II heiß
Phloem des Chinesischen Blauregens
Bild 28: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Bild 28: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 29: Phloem des Chinesischen Blauregens, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 30: Phloem des Chinesischen Blauregens, 2. Asim II lang
  • Bild 31: Phloem des Chinesischen Blauregens, 3. Asim II heiß
Periderm des Chinesischen Blauregens
Bild 32: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Bild 32: Von links nach rechts: 1. W3Asim II kalt, 2. Asim II lang, 3. Asim II heiß
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 33: Periderm des Chinesischen Blauregens, 1. W3Asim II kalt
  • Bild 34: Periderm des Chinesischen Blauregens, 2. Asim II lang
  • Bild 35: Periderm des Chinesischen Blauregens, 3. Asim II heiß
Bei der Zusammensetzung der Farblösungen ist es nicht weiter verwunderlich, dass in den Asim II Varianten die Blautöne überwiegen. Interessant finde ich aber, dass die verschiedenen Methoden, speziell das Erwärmen, einen so großen Einfluss auf die Farbwirkung haben.
Die beiden unterschiedlichen Proben zeigen allerdings auch, dass die zu färbenden Gewebe die Farbwirkung ebenfalls massiv beeinflussen. Weiterhin sei nicht verschwiegen, dass dickere Schnitte (ich selbst schneide ja in der Regel 50 µm dick) die hier beobachteten Tendenzen verstärken, wie die folgende kleine Serie zeigt:   
Übersicht unterschiedlich dicker Schnitte (gefärbt nach Asim II lang)
Bild 36: Oben der dünnere nach Asim II lang gefärbte Schnitt (30 µm), darunter der zufällig etwas dicker geratene aus dem selben Färbegang. Leider kann hier keine genaue Dicke angegeben werden.
Bild 36: Oben der dünnere nach Asim II lang gefärbte Schnitt (30 µm), darunter der zufällig etwas dicker geratene aus dem selben Färbegang. Leider kann hier keine genaue Dicke angegeben werden.
Die Bilder im Einzelnen
  • Bild 37: Die bekannte Übersichtsaufnahme von dem nach Asim II lang gefärbten Präparat mit 30 µm Schnittdicke. Vergrößrung 50x
  • Bild 38: Nun die Übersichtsaufnahme von dem dickeren Schnitt aus dem selben färbegang (Asim II lang). Vergrößerung 50x.
  • Bild 39: Links das primäre Xylem des dünneren, nach Asim II lang gefärbten Schnitts (30 µm), rechts der zufällig etwas dicker geratene aus dem selben Färbegang. Leider kann hier keine genaue Dicke angegeben werden. Vergrößerung 100x.
  • Bild 40: Das primäre Xylem von dem nach Asim II lang gefärbten Präparat mit 30 µm Schnittdicke. Vergrößrung 100x
  • Bild 41: Und hier wieder die dickere Variante aus dem selben Färbegang. Vergrößrung 100x
  • Bild 42: Links das Periderm des dünneren, nach Asim II lang gefärbten Schnitts (30 µm), rechts der zufällig etwas dicker geratene aus dem selben Färbegang. Leider kann hier keine genaue Dicke angegeben werden. Vergrößerung 200x.
  • Bild 43: Das Periderm des nach Asim II lang gefärbten Präparats mit 30 µm Schnittdicke. Vergrößrung 200x
  • Bild 44: Und hier wieder die dickere Variante aus dem selben Färbegang. Vergrößrung 200x
Wer spielen möchte, hat nun natürlich noch jede Menge Freiraum: wie fällt z.B. ein W3Asim II aus, wenn es erhitzt wird? Was wird aus Asim II, wenn es bei Raumtemperatur nur 5 Minuten einwirkt? Wie verhalten sich die Färbungen bei Gräsern oder anderen Monokotyledonen? Wie wirken verschiedene Bleichen und Differenzierungen? Und, und, und ... ;)

Dabei lohnt es sich auf alle Fälle, jede Färbung zu dokumentieren, um ein einmal erreichtes Ergebnis wiederholen zu können und ein Auge für den Einfluß der zu färbenden Proben auf den Ausgang der Färbung zu bekommen.
Dank
Herzlichen Dank an
Herrn Bodo Braunstorfinger für die vielen Schnitte,
Herrn Dr. Klaus Herrmann für den Asim II Ansatz und die Präparate der Korea-Tanne sowie
Herrn Dr. Detlef Kramer für die Bereitstellung der Probe von Wisteria sinensis.
Literatur
[1]  Wacker für alle - neue Simultanfärbungen auf
      Basis der W3A Färbung von Robin Wacker
      Der Artikel zu den W3Asim - Färbungen von Rolf-Dieter Müller
      hier auf unserer Webseite.

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August 2011
Querschnitt durch den Spross des Gartenbambus (Fargesia murieliae). Vergrößerung 100x, Färbung W3Asim II. Aufnahme Jörg Weiß mit Leica C-Plan 10x an Leica DME. Kamera Canon PS A520.
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Juli 2011
Micrasterias rotata aus einer Wasserprobe von der Wuppertalsperre. Aufnahme Holger Adelmann mit der Moticam 2300 am Leitz Orthoplan mit 40er Plan Fluotar und DIC.
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Juni 2011
Bild 1
Angeschliffene Foraminifere aus einem Hydrobienkalk des Untermiozän. Fundort Dexheim bei Mainz. Präparation Fa. Krantz, Aufnahme Prof. Holger Adelmann.
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Juni 2011
Bild 2
Kopf mit Mundwerkzeugen und vorderes Körperdrittel einer nicht näher bestimmten Zuckmückenlarve (Chironomus sp.). Präparation und Aufnahme von Frank Fox.
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Mai 2011
Querschnitt vom Rollblatt des Strandhafers (Ammophila arenaria), Schnittdicke ca. 50 µm, Färbung Wacker W3A. Stitch aus 240 Einzelaufnahmen mit Zeiss Standard WL, Plan Apo 25x/0.65, Kamera Canon EOS 5D MK II mit Vollformat-Chip. Stitching mit Canon Photostitch.
Präparat von Jörg Weiß, Aufnahme von Joachim Schwanbeck.
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April 2011
Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Abdruck von der Blattunterseite, erstellt mit UHU Hart. Hellfeld.
Vergrößerung 200x, Länge des Bildausschnitts im Objekt ca. 0,5 mm. Aufnahme und Präparation von Jörg Weiß.
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März 2011
Auskristallisierte Mineralstoffe aus flüssigem Kunstdünger. Zeiss Jenamed mit Planapochromat 12,4x CF250, polarisiert mit Lambda-Platte, Einzelaufnahme mit Vollformat-Kamera Canon 5D Mark II.  Aufnahme und Präparation von Frank Fox.
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Februar 2011
Nadelquerschnitt der Schlangenhaut-Kiefer (Pinus heldreichii). Aufnahme und Präparation von Rolf-Dieter Müller, Stitch aus ca. 70 Einzelbilder. Schnittdicke 25 µm, Färbung Wacker W3A (Acridinrot, Acriflavin, Astrablau).
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Januar 2011
Achtung, großes Bild!
Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Leitbündel. Aufnahme von Prof. Holger Adelmann, Präparat von Jörg Weiß.
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Dezember 2010
Metapelit, Dicke ca. 25 µm, Präparation durch Willi Tschudin, Aufnahme von Dr. Horst Wörmann.
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November 2010
Simocephalus vetulus (Anomopoda), der Plattkopf- Wasserfloh. Aufnahme von Päule Heck.
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