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Mitose in der Fluoreszenzmikroskopie

Prophase in der Fluoreszenz mit 3 Markern Prophase in der Fluoreszenz mit 3 Markern
Bonn, am 21.04.2016

Eine Frage gab den Anstoß: beim ersten Mint-Camp zum Thema Pflanzenschnitte am Kardinal-Frings-Gymnasium in Beuel konnten wir Bendeikt Westemeyer für einen Vortrag zu seiner Facharbeit zum Thema "Darstellung von Bau und Funktion der Mitosespindeln mit Hilfe des schuleigenen Fluoreszenzmikroskops" gewinnen. Bei unserem April-Treffen war es dann so weit: Herr Westemeyer stellte seine zwischenzeitlich mit Bestnote bewertete Facharbeit und die erzielten Ergebnisse den Mitgliedern der MKB vor, die sich auf einen interessanten und lehrreichen Vortrag freuen konnten.
Das verwendete ZEISS Axioskop 2 MOT Das verwendete ZEISS Axioskop 2 MOT
Herr Westemeyer stellte zunächst das schuleigene Fluoreszenzmikroskop Axioskop 2 MOT und seine Nebenapparate und dessen Funktionsweise kurz vor um dann die Dauerpräparate zur Mitose zu beschreiben, an denen er seine Arbeit gemacht hatte. Dabei handelt es sich um fertig präparierte Zellkulturen von Typ Hela Kyoto #16 mit einer hohen Mitoserate. Somit war sicher gestellt, genügend Zellen in den einzelnen Mitosephasen zu finden, um gute Einsichten in Bau und Funktion des Spindelapparates erlangen zu können.
Die Zellen im Präparat sind mit drei Markern präpariert, die die relevanten Zellbestandteile bei entsprechender Anregung charakteristisch aufleuchten lassen.
1007-information Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe
 
Struktur Farbstoff
Farbe
DNA des Zellkerns
Hoechst 33342
Blau
Tubulin (Spindelapparat)
Alexa 488
Grün
ACA (Anti-Centromer-Antikörper) Alexa 568 Rot
Die Fluoreszenzfarbstoffe färben dabei die gewünschten Strukturen entweder direkt wie bei der DNA, oder quasi huckepack über Antikörper, die spezifisch andocken. Somit ist eine differenzierte "Färbung" sicher gestellt.
Aber drei Farben bei unterschiedlicher Anregung in einem Bild? Wie geht das? Grundsätzlich gibt es hier zwei Methoden, die jeweils ihre Vor- und Nachteile haben. Am einfachsten ist die Arbeit mit einem speziellen Filtersatz, der tatsächlich drei Anregungswellenlängen und die resultierenden Emissionswellenlängen durch lässt, so dass beim Betrachter ein buntes Fluoreszenzbild entsteht. Hier ist man bei der Wahl der Farbstoffe und somit bei der Markierung der Zellstrukturen stark eingeschränkt.
Eine Alternative bietet die elektronische Bildverarbeitung, die hier über das Programm Axiovision und die monochrome Kamera AxioCam MRM der Firma Zeiss zum Einsatz kam: programmgesteuert wird der gewählte Bildausschnitt nacheinander mit den benötigten unterschiedlichen Anregungsfrequenzen angeleuchtet und mit der Kamera eine Aufnahme gemacht. Dabei ist jeweils der passende Filtersatz auszuwählen. Die in diesem Fall drei Bilder werden dann vom Programm verrechnet (übereinander gelegt) und anhand der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe entsprechend eingefärbt. Das Vorgehen ist natürlich bedeutend aufwändiger und für die direkte Beobachtung nur bedingt geeignet, ermöglicht aber jede Freiheit bei der Kombination der benötigten Farbstoffe. 
Basis für die Diskussion der Funktion des Spindelapparates waren Aufnahmen von allen Phasen der Mitose, die im Präparat anhand der im entsprechenden Zustand fixierten Zellen gewonnen wurden.
In der Interphase liegen die Chromosomen im intakten Zellkern entrollt und damit "arbeitsfähig" vor. Am Ende der Interphase bildet sich zunächst ein Zentrosom, an dem schon Mikrotuboli sternförmig andocken.
In der Prophase teilt sich das Zentrosom und die nun zwei Zentrosome wandern an die Zellpole. Im Kern kondernsieren die Chromosomen zu ihrer klassischen "X"-Form. Die beiden schon in der Imnterphase gebildeten identischen Chromatiden hängen nur am Zentromer - der Kreuzungstelle des "X" zusammen.
In der Prometaphase löst sich die Wand des Zellkerns auf und die Spindelfasern des Spindelapparates dringen in den Bereich des ehemaligen Zellkerns ein. An den Zentromeren setzen die Kinetochor- oder Chromosomenmikrotubuli an, durch die die Chromosomen in der Metaphase im Zentrum der Zelle ausgerichtet und in der Anaphase mit Hilfe der Polfasern auseinandergezogen werden können.
In der Metaphase erfolgt die Ausrichtung der Chromosomen in der - gedachten - Ebene der Metaphasenplatte. Jeder Kinetochor ist nun über eine aus Microtubuli gebildete Spindelfaser mit einem der gegenüber liegenden  Zentrosomen verbunden. Neben vielen frei endenden Spindelfasern (Astral-Mikrotubuli) finden sich aber auch welche, die über Motorproteine mit einer Faser vom anderen Zentrosom verbunden sind (Pol-Mikrotubuli)
In der Anaphase werden die beiden Chromatiden eines Chromosoms durch die Spindelfasern getrennt und (mit dem Zentromer voran) in Richtung Spindelpole auseinandergezogen. So erhält jeder Pol einen vollständigen Chromatidensatz. Dabei ziehen die Kinetochor-Mikrotubuli die Chromatiden durch Verkürzung auseinander, während die Zentromere über die Pol-Mikrotubuli zusätzlich auseinander geschoben werden. Damit ist die Basis für die beiden zukünftigen Tochterzellen geschaffen.
Die Telophase ist die letzte Phase der Mitose und folgt übergangslos auf die vorausgegangene Anaphase. Hier löst sich der Spindelapparat durch Depolymerisation der Mikrotubuli auf, die Kernhüllen werden wieder gebildet und die Chromosomen dekondensieren. Erst nach dieser Dekondensation, dem "Entrollen" der Chromatiden, können die Gene wieder abgelesen werden, der Kern hat wieder die Arbeitsform.

Im Anschluss an die durch die Mitose erfolgte Kernteilung erfolgt dann die eigentliche Zellteilung, die Zytokinese, nach der dann zwei vollständige neue Zellen vorliegen, die sich das Zellplasma der Mutterzelle teilen.
Die Phasen der Mitose im Bild
  • Interphase
  • Prophase
  • Prometaphase
  • Metaphase
  • Anaphase A
  • Anaphase B
  • Telophase

Dank

Wir danken Herrn Westemeyer für den interessanten und informativen Vortrag mit anschließender Diskussion, der im Plenum des MKB sehr gut angekommen ist.

Literatur und Links

[ 1]  Vortrag von Herrn Westemeyer zum Herunterladen
       Benedikt Westemeyer
       (2,2 MB, pdf)
      
[ 2]  Fluorescence Microscopy
        From Principles to Biological Application
        Buchbesprechung zum Buch von Ulrich Kubitschek
Text:
Jörg Weiß
Bilder:
Benedikt Westemeyer

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Eidechsenschwanz (Houttuynia cordata), Leitbündel. Aufnahme von Prof. Holger Adelmann, Präparat von Jörg Weiß.
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